[发明专利]一株PK-15稳定细胞株的构建及应用在审
| 申请号： | 201910746642.9 | 申请日： | 2019-08-13 |
| 公开（公告）号： | CN110452928A | 公开（公告）日： | 2019-11-15 |
| 发明（设计）人： | 邢刚;粟硕;黄杰;贺微;岳丰雄;徐祥兰;王洁清;刘原子;何洪奎;江勇;王立斌 | 申请（专利权）人： | 成都天邦生物制品有限公司;马鞍山史记动物健康管理有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 51222 成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李高峡;张娟<国际申请>=<国际公布>= |
| 地址： | 610000四川省成*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | 本发明涉及细胞生物学、基因工程和兽用生物制品学技术领域，特别是涉及一株PK‑15稳定细胞株的构建方法及应用。本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)繁殖用细胞株的构建方法，包括如下步骤：1)将CD163基因和SBQ基因分别构建到慢病毒载体中，得重组慢病毒载体；2)将前述重组慢病毒载体和病毒拯救辅助质粒一起转入哺乳动物细胞，培养该细胞，得重组病毒；3)将步骤2)的重组病毒感染PK‑15细胞，即得。本发明还提供了前述细胞的用途。本发明得到的细胞遗传性状稳定，对PRRSV敏感，具有十分优良的应用前景。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 细胞 重组慢病毒载体 重组病毒 繁殖与呼吸综合征病毒 细胞生物学 哺乳动物细胞 兽用生物制品 慢病毒载体 稳定细胞株 病毒拯救 辅助质粒 基因工程 遗传性状 基因 细胞株 种猪 应用 繁殖 转入 敏感 感染 | ||
【主权项】：
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒繁殖用细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)将CD163基因的整个编码区序列构建到/nPCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体中，将SBQ基因的整个编码区序列构建到PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体中，得重组慢病毒载体；/n2)将前述重组慢病毒载体和病毒拯救辅助质粒先后转入哺乳动物细胞，培养该细胞，得重组病毒；/n3)将步骤2)的重组病毒感染PK-15细胞，即得；/n步骤1)所述PCDH-CMV-MCS-EF1A-MCHEERY-T2A-PURO慢病毒载体是在PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-PURO载体基础上将copGFP基因替换为MCHEERY改造得到；/n所述PLVX-CBA-IRES-NEO-T2A-EGFP慢病毒载体是在PLVX-IRES-NEO载体和PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体基础上构建，具体的：以PCDH-CMV-T2A-EGFP-EF1A-PURO载体为模板扩增EGFP和T2A序列，将EGFP和T2A序列通过酶切连接的方法嵌入到PLVX-IRES-NEO载体的WPRE和NEO元件之间，并在改造后的载体上将CBA启动子序列嵌合至CMV promoter之后；/n步骤2)所述辅助质粒指的是慢病毒结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G，重组慢病毒载体、结构质粒psPAX2和囊膜质粒PMD2.G的质量浓度比为4∶3∶1。/n
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