[发明专利]达氏鲟三个内参基因、引物开发及稳定性评价技术方法

摘要

本发明公开了一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，包括如下方法步骤：通过高保真酶的PCR扩增反应得到三个达氏鲟内参基因，对三个达氏鲟内参基因实时荧光定量引物的开发，通过标准曲线和熔解曲线评估三个达氏鲟内参基因引物的质量，评价三个达氏鲟内参基因在组织表达中的稳定性；该种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，通过提供了三个内参基因ACT、GAPDH和EF1‑α基因全长编码区，为达氏鲟荧光定量研究提供了更多的内参基因选择，利用ACT、GAPDH和EF1‑α核苷酸序列为基础开发了荧光定量引物，大大提高了荧光定量研究可靠性和可重复性，评价了ACT、GAPDH和EF1‑α在组织表达中的稳定性，为达氏鲟荧光定量研究提供稳定适宜的内参基因。

主权项

1.一种基于转录组的准确、高效的真核生物基因鉴定方法，包括β肌动蛋白、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶和延伸因子1α三个达氏鲟内参基因，其特征在于，包括如下方法步骤：步骤一，以丝瓜cDNA为模板、并以如下引物对进行高保真酶的PCR扩增反应得到三个达氏鲟内参基因，引物对为：ACT正向引物5'‑ATGGAAGACGAAATTGCCG‑3'ACT反向引物5'TTAGAAGCATTTACGGTGGACGA‑3'GAPDH正向引物5'‑GAATCTCACTCAGACGAGGACTT‑3'GAPDH反向引物5'GGTGTGTGGTTTAAGTGATGTCA‑3'EF1‑α正向引物5'‑ATGGGAAAGGAAAAGACCCACATC‑3'EF1‑α反向引物5'GGACAGTCCAGGGGATGGTGGTT‑3'步骤二，三个所述达氏鲟内参基因实时荧光定量引物的开发，以步骤一中达氏鲟内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物，实时荧光定量PCR引物对如下：qACT正向引物5'‑CTGTTTCAGCCATCCTTCTTG‑3'qACT反向引物5'TTGATTTTCATTGTGCTCGGT‑3'qGAPDH正向引物5'‑TCAAATGGGGTGATGCTGGAG‑3'qGAPDH反向引物5'GCGGAGATGATGACACGCTTAG‑3'qEF1‑α正向引物5'‑GAAAGGAAAAGACCCACAT‑3'qEF1‑α反向引物5'CCAGGCATACTTGAAGGAGC‑3'步骤三，通过标准曲线和熔解曲线评估三个达氏鲟内参基因引物的质量，步骤四，使用但不限于geNorm，NormFinder和Bestkeeper软件评价三个达氏鲟内参基因在组织表达中的稳定性。