[发明专利]一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法

摘要

本发明公开了一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法，包括以下步骤：S1：克隆筛选标记元件：从pGBK‑T7载体中克隆了由Ampr启动子驱动的卡那霉素抗性基因Kanr，以此元件(pAmpr::Kanr)作为后续的筛选标记；S2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的RuBisCO大亚基基因(rbcL)的启动子序列，该启动子用于驱动待检测的酶基因；S3：酶基因的克隆：来自不同生物的待鉴定类胡萝卜素代谢相关酶基因X克隆于rbcL启动子的下游(rbcL::X)，由该启动子驱动；S4:表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pAmpr::Kanr筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcL::X元件。与传统鉴定方法相比，本方法具有更加简便、直接的优势，可以明确而有针对性地对基因功能进行鉴定。

主权项

1.一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：克隆筛选标记元件：从pGBK-T7载体中克隆了由Amp^r启动子驱动的卡那霉素抗性基因Kan^r，以此元件(pAmp^r::Kan^r)作为后续的筛选标记；/nS2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的RuBisCO大亚基基因(rbcL)的启动子序列，该启动子用于驱动待检测的酶基因；/nS3：酶基因的克隆：来自不同生物的待鉴定类胡萝卜素代谢相关酶基因X克隆于rbcL启动子的下游(rbcL::X)，由该启动子驱动；/nS4:表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pAmp^r::Kan^r筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcL::X元件；/nS5：质粒构建：在构建好的表达盒的两端，通过PCR技术扩增引入集胞藻基因组插入位点两侧的同源臂序列，并将扩增片段克隆到载体中；/nS6：蓝细菌菌株培养：选取合适的蓝细菌菌株，并对蓝细菌菌株进行培养；/nS7:蓝细菌的转化：S5克隆的质粒通过自然转化的方法转化蓝细菌；经转化的蓝细菌在含有50μg ml^-1卡那霉素的BG-11培养基平板上筛选，其他培养筛选条件同S6；/nS8：色素鉴定：当S7液体培养基中蓝细菌生长至OD₇₀₀＝2.0时，取5ml菌液离心收集细胞，以甲醇抽提积累的类胡萝卜素，利用高效液相色谱法对色素进行分离鉴定。/n