[发明专利]采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法

摘要

本发明公开了一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法。本发明具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染、PCR热不稳定的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法适应性更强、效果更好。且本发明简单易懂，便于操作。

主权项

1.一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)提取屠宰后的发情期产单羔、产多羔的黔北麻羊母羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢10个性腺组织的总RNA；采用超微量分光光度计与1％琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的特异性、完整性以及纯度；(2)对提取的符合要求的总RNA依据逆转录试剂盒合成cDNA第一链；并以逆转录后的cDNA第一链为模板，分别对目的基因CTSB和内参基因β‑actin进行普通PCR扩增；(3)目的基因CTSB上游引物的序列为5'‑TGACTCGCATGTAGGTTGC‑3'、下游引物的序列为5'‑TGGAGACGCTGTAGGAA‑3'；内参基因β‑actin上游引物的序列为5'‑AGATGTGGATCAGCAAGCAG‑3'、下游引物的序列为5'‑CCAATCTCATCTCGTTTTCTG‑3'；PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。(4)将电泳检测出的目的条带切下，切胶回收产物与pMD19‑T载体连接，再转化为大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，将鉴定为阳性的菌液进行测序，将测序正确的菌液进行扩繁与质粒提取工作，并将获得的重组质粒进行定量稀释，以稀释后的重组质粒作为模板，采用实时荧光定量PCR扩增目的基因CTSB与内参基因β‑actin，获得标准曲线与熔解曲线；利用2‑ΔΔCt相对定量法计算目的基因CTSB的相对表达量，并检测差异表达量。