[发明专利]表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用

摘要

本发明公开了一种成本低、灵敏度高、稳定性好的表面增强拉曼散射纸基传感器的制备方法并成功将其用于肿瘤标志物的检测。通过蜡打印技术在纸芯片上制备工作区，并在工作区原位生长生物相容性好且可以增强拉曼信号的多孔金纳米粒子，利用将有机信号分子嵌入到金银核壳纳米棒中间，大大减少了外界环境的干扰，产生更强的拉曼信号和非常低的背景噪音，从而实现对肿瘤标志物的精准检测。

主权项

1.表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用，其特征包括以下步骤：1.1在计算机上使用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的亲疏水区域；所述对纸芯片进行亲疏水区域的设计，其特征在于所设计的图案有白色和绿色两个颜色区域，其中白色区域即工作区域的直径尺寸为6 mm；1.2将2号色谱纸裁剪成A4纸大小，然后使用蜡打印机打印步骤1.1中设计的图案，随后，将蜡打印的纸芯片放到烘箱中烘烤使蜡融化，形成疏水墙，没有打印蜡的部分为亲水工作区；1.3在亲水工作区域生长多孔金纳米粒子，得到金纳米粒子功能化的工作区，定义为AuNPs/PWE；所述在亲水工作区域生长多孔金纳米粒子，得到AuNPs/PWE，其特征是包括以下步骤：首先合成金种子溶液：量取80 mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90 °C后加入0.8 mL氯金酸，将溶液加热至96 °C并保持1 min，随后加入2.5‑3.0 mL质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌15 min，自然冷却至室温；其次在纸芯片工作区域生长多孔金纳米粒子：将新制备的金种子溶液滴加到纸芯片亲水工作区，自然晾干，该步骤重复3次，将新鲜制备的浓度为200 mM的盐酸羟胺溶液和质量分数为1%的氯金酸溶液快速均匀混合，然后滴加到纸芯片工作区域并在室温下孵育40 min，使用二次水冲洗纸芯片，室温下自然晾干，重复上述过程一次，完成多孔金纳米粒子的生长，得到AuNPs/PWE；1.4将修饰有生物素的肽链固定在步骤1.3所得到的纸芯片的工作区域，再用缓冲溶液清洗后，用巯基己醇减少非特异性吸附位点；所述肽链的固定以及巯基己醇封锁活性位点，包括以下步骤：将60 μL浓度为0.01 mM的修饰有生物素的肽链滴加到AuNPs/PWE，在4 °C下孵育12 h，用磷酸盐缓冲液清洗后，将60 μL质量分数为1%的巯基己醇加入到纸芯片上孵育1 h，以减少非特异性吸附位点；1.5将一定浓度的前列腺特异性抗原溶液滴加到步骤1.4所得的纸芯片的表面，37 °C下孵育40 min进行肽链的切割；1.6将修饰有链霉亲和素定义为SA的表面增强拉曼散射探针滴加到完成肽切割的纸芯片上，37 °C下孵育2 h，在纸芯片表面引入探针；所述在纸芯片的表面引入探针，包括以下步骤：首先探针的制备过程分为四步，第一步制备种子溶液：称取0.7289 g十二烷基三甲基溴化铵溶解于10 mL水中，在磁力搅拌下，依次加入10 mL浓度为0.0005 M的氯金酸和1.2 mL冰的浓度为0.01 M的四氢硼钠，继续磁力搅拌2 min后得到种子溶液；第二步制备生长液：室温下，将5 mL浓度为0.2 M的十二烷基三甲基溴化铵溶液与0.2 mL浓度为0.004 M的AgNO₃溶液混合，随后加入5 mL浓度为0.001 M的氯金酸溶液，缓慢搅拌后，加入70 μL浓度为0.0788 M的抗坏血酸，生长液的颜色慢慢由深黄色变为无色；第三步，制备金纳米棒，定义为Au NRs：在30 °C下，10‑20 μL种子溶液被加入到上述生长液中，反应40 min，用二次水洗涤数次得到Au NRs；第四步，制备表面增强拉曼散射探针：将700‑1000 μL 4‑巯基苯甲酸，定义为4‑MBA，加入到1 mL Au NRs溶液中，得到的混合液在室温下放置6 h，将溶液于12000 rpm下离心5 min以除去多余的4‑MBA，得到的固体被重新分散在1 mL二次水中，将此分散液在磁力搅拌下加入到5 mL浓度为0.04 M的十二烷基三甲基溴化铵溶液中，随后，分别加入150 μL浓度为0.01 M的AgNO₃溶液，130 μL浓度为0.1 M的抗坏血酸溶液和290 μL浓度为0.1 M的NaOH溶液，磁力搅拌1 h后在12000 rpm转速下离心5 min，用二次水清洗一次，将沉淀分散到1 mL水中；其次制备SA修饰的探针：50‑200 μL的浓度为1 mg/mL的SA被加入到500 μL的上述探针溶液中，混合物在4 °C条件下震荡12 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗除去多余的SA，得到SA修饰的探针；最后，SA修饰的探针被重新分散在500 μL含有质量分数为1%的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中孵育4 h，随后，将60 μL修饰有SA的表面增强拉曼散射探针滴加到步骤1.5所得的纸芯片上，37 °C下孵育2 h，使用二次水彻底洗涤纸芯片3次，于室温下干燥50 min；1.7精确表面增强拉曼散射测定：将步骤1.6所得到的纸芯片放入在拉曼检测台上，完成测定，绘制拉曼强度与前列腺特异性抗原浓度之间的关系曲线，实现前列腺特异性抗原的精确检测。