[发明专利]一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法

摘要

一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法。本发明公开了一种纸基双模式检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法。利用蜡打印技术在纸上制备疏水区域和亲水区域，并借助丝网印刷技术，印制电极和导线，利用切割技术形成折叠设备。通过多种方法对纸芯片的不同区域进行功能化，利用腺嘌呤核苷三磷酸和适配体的特异性识别作用以及葡萄糖氧化酶对葡萄糖的特异性催化，利用超级电容器的储能作用通过万用表检测瞬时电流从而提高灵敏度，并且借助电化学工作站可以实现对待测物的超灵敏的电化学检测。

主权项

1.一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法，其特征是包括以下步骤：(1) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS6软件设计一个十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水区域，该纸器件包含电极标签，检测区，反应区，中空区域以及超级电容器标签；(2) 采用丝网印刷的方法，将碳工作电极印刷到检测区，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到电极标签，碳电极印刷到反应区，碳线印刷到绿色区域作为工作电极和超级电容器的桥梁，将中空区域中疏水蜡包围的圆形亲水区域居中进行打孔，将红色区域的实线进行切割，虚线进行折叠，形成一个立体结构；(3) 对检测区的圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长海胆状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80 mL二次水倒入三口烧瓶中加热至90℃，并加入800 μL质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1 min，最后加入2.8 mL质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15 min，自然冷却得到金种子溶液，取20 μL得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，将100 μL 200 mmol/L的抗坏血酸和100 μL质量分数为1%的氯金酸溶液混合，取20 μL混合溶液滴加到修饰有金种子的工作区域，静置30 min，用二次水冲洗3次，其次，取10 μL 100 mmol/L DNA1滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，在4℃下孵育一夜，用10 mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液多次冲洗掉未固定的DNA1，继续滴加10 μL 40 nmol/L的aptamer在环境温度37℃下孵育50 min，用10 mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干，继续滴加10 μL的1%的牛血清白蛋白进行封闭，在室温下反应50 min，所述的DNA1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰有1个氨基和6个亚甲基；(4) 在检测区圆形亲水工作区域修饰DNA2/葡萄糖氧化酶复合物，具体步骤为：用10 mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液来活化DNA2，随后，将过量的戊二醛交联剂加入到含有1 μmol/L 的葡萄糖氧化酶的500 mL pH为7.3的25 mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中，并将混合物摇动15min，通过用离心过滤装置分离纯化产物，随后加入100 μmol/L的DNA2反应2 h，用离心过滤装置纯化所得产物，取10 μL得到的DNA2/葡萄糖氧化酶复合物滴加到检测区圆形亲水工作区域，并于37℃环境反应2 h，将此工作区域用10 mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液冲洗以减少非特异性吸附，所述的DNA2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其3’端修饰有1个巯基和7个亚甲基；(5) 在反应区圆形亲水区域进行修饰，具体步骤为：20 μL 100 mmol/L的铁氰化钾滴加到圆形亲水区域，自然晾干，重复三次，继续滴加20 μL 100 mmol/L的葡萄糖溶液，静置晾干，重复三次；(6) 在超级电容器标签预留空白区域制作超级电容器，具体步骤为：首先，在超级电容器标签预留空白区域用碳铅笔均匀的涂覆，形成导电电极，随后，通过将6 g用乙醇醇化的聚乙烯醇粉末，6 g磷酸和60 mL二次水混合在一起并加热至85℃直至溶液变澄清来制备固态电解液，将石墨涂覆的纸浸入固态电解液中恒定一段时间并取出，重复2~3次，紧接着置于蒸发皿中并在烘箱中干燥，当电解质干燥时，用碳铅笔将石墨涂覆在电解质上以形成夹层结构；(7) 在检测区圆形亲水工作区域滴加含有腺嘌呤核苷三磷酸的待测溶液，自然晾干，其次，通过折叠将检测区与反应区域的圆形亲水区重叠，工作电极和碳线接触，用夹子固定，10 mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液滴加到检测区圆形亲水工作区，产生用于给超级电容器充电的电压，通过数字万用表检测电流并记录；(8) 清洗检测区的圆形亲水工作区域之后，使检测区和电极标签重叠，用夹子固定，与电化学工作站连接，将40 μL含有10 mmol/L的葡萄糖和50 μmol/L 的二茂铁羧酸的pH为6.9的磷酸缓冲盐溶液滴到电极标签，进行测定并记录；(9) 分别绘制两种检测方式的电流与腺嘌呤核苷三磷酸浓度的标准曲线，完成腺嘌呤核苷三磷酸的双模式测定。