[发明专利]一种基于共焦拉曼免疫时域分辨荧光的动物血液检测方法

摘要

本发明公开了一种基于共焦拉曼免疫时域分辨荧光的动物血液检测方法，该方法是在微流控共焦拉曼免疫时域分辨荧光检测仪上实现的，该方法包括初始化及自聚焦、共焦拉曼光谱信息获取、免疫时域分辨荧光光谱信息获取、综合光谱数据后处理四个步骤。本发明的有益效果是，光路的共焦设计可有效提高空间分辨率，可对血液中的微小区域分子进行探测；长荧光寿命免疫标记为多次时域分辨采样提供了基础；条纹相机传感器光谱仪实现单次激光诱导荧光多次采集；共焦拉曼与多幅时域荧光提供综合光谱信息，提高物种血液鉴别能力。

主权项

1.一种基于共焦拉曼免疫时域分辨荧光的动物血液检测方法，该方法是在微流控共焦拉曼免疫时域分辨荧光光谱血液检测仪上实现的，所述检测仪由三维电动平台(1)、显微物镜(2)、双色片(3)、光纤耦合镜(5)、荧光接收光纤(6)、荧光光谱仪(7)、条纹相机传感器(8)、数字延迟发生器(9)、紫外激光扩束镜(10)、紫外低重频脉冲激光器(11)、主控制器(12)、无线网络收发器(13)、废液罐(16)、拉曼物镜(31)、拉曼光谱仪(33)、拉曼光纤(34)、拉曼耦合镜(35)、拉曼双色片(37)、拉曼扩束镜(38)、拉曼激光器(39)、瑞利滤光片(40)、自聚焦模组(41)及自动进样系统组成；其特征在于所述的方法包括以下步骤：/n1)初始化及自聚焦/n将珍稀动物待测血液注入血液管，将螯合标记物注入试剂管；将自动进样台的电动推进器、检测细管、血液管、血液接头组装好；将试剂进样台的试剂推进器、试剂管、试剂接头、Y形管组装好；将中间接头联接好检测细管与Y形管；将Y形管与废液罐接好；然后将整个自动进样系统安装于三维电动平台上；/n主控制器发出指令启动电动推进器，以一定的速度推动血液管中的待测血液通过血液接头流入检测细管，并通过中间接头流入Y形管；主控制器发出指令启动试剂推进器，以一定的速度推动试剂管中的螯合标记物与检测细管中的待测血液在Y形管中相遇混合，产生免疫反应后，生成荧光标记位点，得到标记血液，从Y形管出口流出；/n主控制器发出指令，启动数字延迟发生器；数字延迟发生器按设置的延迟T，发出两个触发脉冲，先后启动紫外低重频脉冲激光器和条纹相机传感器；主控制器发出指令，使条纹相机传感器工作于单帧曝光模式，并设置曝光时间Es；/n紫外低重频脉冲激光器发出的紫外脉冲激光扩束聚焦至Y形管出口区域，产生的后向信号经光纤耦合镜耦合进入荧光光谱仪，到条纹相机传感器进行光电转换；条纹相机传感器将采集到的光谱信号传送到主控制器；主控制器计算该光谱信号的总强度I，即光谱曲线包围的总面积；/n主控制器发出指令，控制三维电动平台沿XYZ三个轴进行步进微动调整，在每个位置，数字延迟发生器按设置的延迟T，发出两个触发脉冲，先后启动紫外低重频脉冲激光器和条纹相机传感器；主控制器计算该位置回波光谱信号的总强度I，直至I到达最大值，此时，紫外激光已准确聚焦至Y形管出口中的标记血液；/n2)共焦拉曼光谱信息获取/n主控制器发出指令启动自聚焦模组、拉曼激光器及拉曼光谱仪，并设定拉曼光谱仪的曝光时间；拉曼激光器发出的拉曼泵浦激光扩束聚焦至检测细管区域，产生的后向信号经拉曼耦合镜耦合进入拉曼光谱仪，拉曼光谱仪将采集到的光谱信号传送到主控制器；主控制器计算该光谱信号的总强度IR，总强度IR为光谱曲线包围的总面积；/n主控制器发出指令，由自聚焦模组带动拉曼物镜沿拉曼发射轴上下移动，在每个位置，主控制器计算该位置回波光谱信号的总强度IR，直至IR到达最大值，此时，拉曼泵浦激光准确聚焦至检测细管中的待测血液；在此紧聚焦状态下，拉曼光谱仪将拉曼聚焦点处待测血液的拉曼光谱信号传送到主控制器；/n3)免疫时域分辨荧光光谱信息获取/n在此紧聚焦状态下，主控制器发出指令，使条纹相机传感器工作于连续多帧采集模式；设置单帧曝光时间Em、采样周期Δt以及总采集时间B；数字延迟发生器按设置的延迟T，发出两个触发脉冲，先后启动紫外低重频脉冲激光器和条纹相机传感器；/n紫外低重频脉冲激光器发出的紫外脉冲激光扩束聚焦至标记血液，产生的后向免疫荧光信号经光纤耦合镜耦合进入荧光光谱仪，到条纹相机传感器进行光电转换；/n条纹相机传感器将采集到的光谱信号传送到主控制器；条纹相机传感器按设置好的单帧曝光时间Em、采样周期Δt以及总采集时间B进行时域分辨高速连续曝光，将随时间衰减的由单发激光脉冲激发的B/Δt个荧光光谱记录下来并送至主控制器；/n4)综合光谱数据后处理/n主控制器对待测血液的共焦拉曼谱线、以及B/Δt个荧光光谱进行曲线形态，曲线时域变化速率等参数进行提取及分析，构建其综合光谱特征数据库，并将数据库信息通过无线网络收发器送至出入境监管部门云系统；对珍稀动物血液进行快速检测、建库与识别，方便海关进出口检测检疫部门进行珍稀动物的溯源、鉴别及保护。/n