[发明专利]大片形吸虫分泌排泄产物诊断抗原的制备方法与应用

摘要

本发明提供大片形吸虫分泌排泄产物诊断抗原的制备方法与应用，一种大片形吸虫分泌排泄产物诊断抗原有效成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)大片形吸虫分泌排泄产物制备；(2)层析组分收集；(3)层析组分的筛选。本发明还提供一种检测/辅助大片形吸虫病的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的F22层析组分。本发明还涉及含有诊断抗原在检测/辅助水牛大片形吸虫病早期诊断中的应用。本发明筛选出的F22层析组分作为大片形吸虫分泌排泄产物诊断抗原具有检测快速、操作简便、易于判定等优点，能够为水牛大片形吸虫的检测提供实用有效的方法。

主权项

1.一种大片形吸虫分泌排泄产物诊断抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)大片形吸虫分泌排泄产物制备：采集感染大片形吸虫的水牛胆囊，收集胆囊中的大片形吸虫，用1×PBS缓冲液进行虫体培养，将培养液进行离心处理，取上清，得到大片形吸虫分泌排泄产物，将收集的所有批次大片形吸虫分泌排泄产物混合，将蛋白冻干浓缩，用于层析；/n(2)层析组分收集：用蛋白质快速层析仪将50mg大片形吸虫分泌排泄产物以1mL/min收集流速，在UV280条件下，进行层析组分收集，每次层析收集96管层析组分，并依据收集顺序将收集到的层析组分分别命名为F1、F2.....F96，共进行5次层析，每次层析用5mL的冻干浓缩分泌排泄产物，浓度为10mg/ml，每次蛋白量为50mg，并将5次层析，标记序号对应的5管分别进行混合，冻干浓缩，由层析图分析，主要有3个峰，层析组分从第19管开始，第一个峰为第19管到第25管；/n(3)层析组分的筛选：采用间接ELISA方法，以大片形吸虫分泌排泄产物、层析第一个波峰及其附近不同层析组分作为抗原，用实验室保存4wpi，14wpi感染大片形吸虫水牛阳性血清与各层析组分反应，通过比较各个组分与血清反应的阳性平均值/阴性平均值高低筛选出4wpi阳性平均值/阴性平均值最高的F22层析组分；/n所述间接ELISA方法的具体步骤如下：/na、包被：用0.05M的碳酸缓冲液将大片形吸虫分泌排泄产物抗原稀释至2.5μg/mL，1.0μg/mL，选取冻干浓缩后第一个波峰左右的层析组分F21-F33进行稀释为1μg/mL，F19，F20层析组分用BCA蛋白试剂盒未测出浓度，因此F19，F20层析组分浓度按10倍，50倍，100倍稀释，每孔加100μL，在37℃恒温箱孵育2.5h，4℃包被过夜；/nb、封闭：用洗涤缓冲液PBST洗涤4次，150μL/孔，每次5min。加入1％明胶封闭液，每孔加150μL，在37℃恒温箱孵育2h；/nc、血清：用洗涤缓冲液PBST洗涤4次，200μL/孔，每次5min。血清用PBST以1:400稀释后，每孔100μL，设3个重复孔，37℃恒温箱孵育1h；/nd、酶标二抗：用洗涤缓冲液PBST将96孔板洗涤4次，200μL/孔，每次计时5min。将辣根过氧化物酶标记羊抗牛IgG，用PBST以1:40000稀释，每孔100μL，在37℃恒温箱孵育1h；/ne、显色液：用洗涤缓冲液PBST将96孔板洗涤4次，200μL/孔，每次计时5min。避光加入显色液，每孔加入100μL，在37℃恒温箱孵育20min；/nf、终止液：每孔加50μL，OD_450nm处读取吸光值。/n