[发明专利]一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法，该方法包括以下步骤：（1）建立细胞悬浮培养系；（2）预培养：将悬浮细胞接种到预培养基中4~6℃培养5d；（3）预处理：将悬浮细胞先后用预冷的玻璃化液、冷冻保护剂处理；（4）冷冻保存：悬浮细胞加入预冷的冷冻保护剂直接投入液氮保存；（5）化冻和洗涤：40℃水浴化冻，再重复洗涤3~5次；（6）恢复培养。本方法针对杜仲悬浮细胞特性，摸索出了合适的预培养基和冷冻保护剂，并对整个技术流程进行优化，应用本发明的方法保存的杜仲悬浮细胞，其成活率可达88%以上，并且所需设备简单，处理步骤方便，重复性好，细胞保存长期安全稳定，成本较低。

主权项

1.一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n（1）建立细胞悬浮培养系：选取生长旺盛、结构疏松、易于分散的杜仲愈伤组织接种到悬浮培养基中，置于恒温摇床上进行振荡培养；培养10d后，用40目筛网过滤除去大的愈伤组织块和较大的细胞团；培养过程每20~25d继代1次，继代3~4次得到只含单细胞或小细胞团的细胞悬浮培养系；/n（2）预培养：选取培养12~16d的杜仲悬浮细胞作为保存材料，首先接种到预培养基中，置于4~6℃预培养5d；/n（3）预处理：对步骤（2）的培养物进行离心处理，除去上清液，分离出悬浮细胞加入预冷到4℃的玻璃化液中处理35~45min；再次离心处理，除去上清液，分离出悬浮细胞加入预冷到0℃的冷冻保护剂中，并且在0℃冰浴处理25~35min；/n（4）冷冻保存：悬浮细胞经预处理后吸去原有的冷冻保护剂并换入新鲜的预冷到0℃的冷冻保护剂，使之浸没细胞，密封冷冻管迅速投入液氮（-196℃）中冷冻保存；/n（5）化冻和洗涤：将冷冻管从液氮中取出，放入40℃水浴化冻1~2min，待冷冻管内的冰融化后，立即加入含1.2mol/L蔗糖的B₅液体培养基，先轻微振摇，再停留约15min，最后倒出溶液，同法重复洗涤3~5次；/n（6）恢复培养：杜仲悬浮细胞经化冻洗涤处理后转接到悬浮培养基中，在23±2℃、黑暗条件下培养14d以上。/n