[发明专利]一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法

摘要

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，包括实验材料的准备、单点突变、目的基因片段扩增、表达载体双酶切及T5外切酶处理、转化、阳性转化子检测、测序比对以及碱基缺失。本发明在目的基因突变位点周围分成两段DNA片段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2，其中突变或缺失碱基位点设计在R1、F2中，R1与F2要有至少20bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置有至少20bp的同源臂，基因片段和载体片段在T5外切酶作用后，利用大肠杆菌自身的修复系统就可以得到含有目标位点的环状质粒，该方法同样适用于多位点碱基突变或缺失。

主权项

1.一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/nS1、实验材料的准备：大肠杆菌DH5α克隆感受态、融合目的基因的质粒载体pET28a-XXX和空载体pET28a、限制性内切酶BamHI和XhoI、Pfu高保真DNA聚合酶、金牌MIX、T5外切酶，同时实验室需要用到引物F1:5’—3’；/nS2、单点突变：在突变位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a被BamHI和XhoI双酶切之后两端有20bp同源臂；/nS3、目的基因片段扩增：以含有目的基因的载体pET28a-XXX为模板，以F1、R1和F2、R2为引物对进行PCR扩增，分别扩增出基因的两个片段，分别为片段1以及片段2；/nS4、表达载体双酶切及T5处理：pET28a空载体用BamHI和XhoI进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收，将基因片段1、2和载体pET28a(BamHI和XhoI双酶切)、BamHI和XhoI双酶切在T5反应体系下30℃，40mins，然后将样品置于冰上终止反应，T5反应体系为20uL，具体包括基因片段1为3n、基因片段2为3n、载体片段为n、5×T5外切酶反应buffer为4uL、T5外切酶为1-0.3uL、无菌ddH2O补至20uL，其中n为摩尔数、uL表示加样体积；/nS5、转化：终止T5反应后，立即进行克隆转化，从反应体系中取10uL样品于冰上与100uLDH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500uL SOC培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于抗性卡那霉素固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；/nS6、阳性转化子检测：在完成S5步骤后，从上述的转化平板中挑取5个单菌落于10uL无菌水中，即为PCR模板,以全长目的基因前后引物F1、R2为引物对，进行菌落PCR，菌落PCR体系为10uL，具体包括模板为1uL、正向引物以及反向引物均为0.5uL、金牌MIX为8uL；/nS7、在完成S6步骤后进行测序比对；/nS8、碱基缺失：在目的碱基缺失位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂。碱基缺失突变除了引物与点突变引物有区别外，实验过程与点突变过程一致。/n