[发明专利]一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除amh基因的方法及应用有效
申请号: | 201910878579.4 | 申请日: | 2019-09-18 |
公开(公告)号: | CN110684767B | 公开(公告)日: | 2022-03-11 |
发明(设计)人: | 卢建国;李石竹;方文宇 | 申请(专利权)人: | 中山大学 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/90;C12Q1/6858;A01K67/027 |
代理公司: | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人: | 汤东凤 |
地址: | 510275 *** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | 本发明公开了一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除amh基因的方法,包括以下步骤:(1)靶位点1设计在黄颡鱼amh基因第一外显子上,靶位点2设计在第四外显子上;(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性,用amh E1 F和amh E1 R扩增靶位点1及附近序列,用amh E4 F和amh E4 R扩增靶位点2及附近序列;(3)以pUC19‑gRNA‑scaffold质粒为模板,用amh E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增,用amh E4 gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增;以上述PCR产物为模板,体外转录并纯化获得gRNA;(4)以pXT7‑hCas9线性化质粒为模板,体外转录合成Cas9 mRNA;(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中;(6)检测突变类型,计算基因编辑率。本发明还公开了上述方法的应用。 | ||
搜索关键词: | 一种 黄颡鱼中双 grna 位点敲 amh 基因 方法 应用 | ||
【主权项】:
1.一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除amh基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:/n(1)靶位点1设计在黄颡鱼amh基因第一外显子上,靶位点2设计在第四外显子上;/n(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性,用amh E1 F和amh E1 R扩增靶位点1及附近序列,用amh E4 F和amh E4 R扩增靶位点2及附近序列;/n(3)以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板,用amh E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增,用amh E4 gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增;以上述PCR产物为模板,体外转录并纯化获得gRNA;/n(4)以pXT7-hCas9线性化质粒为模板,体外转录合成Cas9 mRNA;/n(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中;/n(6)检测突变类型,计算基因编辑率。/n
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