[发明专利]一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法和应用在审
| 申请号： | 201910880224.9 | 申请日： | 2019-09-18 |
| 公开（公告）号： | CN110684724A | 公开（公告）日： | 2020-01-14 |
| 发明（设计）人： | 刘威;张洪;贾坤同;易梅生 | 申请（专利权）人： | 中山大学 |
| 主分类号： | C12N5/076 | 分类号： | C12N5/076 |
| 代理公司： | 11350 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 510275 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，包括以下步骤：取出中华乌塘鳢雄鱼精巢，清洗、消毒和剪碎，将精巢碎块置于消化液中，在恒温水平摇床上进行消化，制备成精巢细胞悬液；经细胞网筛过滤去除未完全消化的组织或大的细胞团，将过滤后的细胞经Percoll梯度低速离心，收集低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞；加入中华乌塘鳢精子培养基和添加蛋白质添加剂进行重悬，接种到3D细胞培养皿中培养；在3D培养过程中，利用免疫荧光检测其中的生殖细胞；每2‑5天更换一半新鲜精子培养基，统计精子数量，曙红Y染色检测培养精子的存活率；将3D培养产生的中华乌塘鳢精子与中华乌塘鳢成熟卵子进行体外受精，统计胚胎的受精率。 | ||
| 搜索关键词： | 中华乌塘鳢 精子 低速离心 精巢细胞 培养基 精巢 过滤 生殖细胞 碎块 蛋白质添加剂 免疫荧光检测 细胞培养皿 细胞 消化 成熟卵子 恒温水平 染色检测 体外受精 细胞悬液 存活率 受精率 细胞团 消化液 曙红Y 剪碎 网筛 雄鱼 摇床 重悬 去除 制备 接种 胚胎 清洗 取出 统计 消毒 新鲜 | ||
【主权项】：
1.一种3D培养中华乌塘鳢精巢细胞产生精子的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)解剖中华乌塘鳢雄鱼，取出精巢，清洗、消毒和剪碎，将精巢碎块置于消化液中，在恒温水平摇床上进行消化，制备成精巢细胞悬液；/n(2)将精巢细胞悬液经细胞网筛过滤去除未完全消化的组织或大的细胞团，将过滤后的细胞经Percoll梯度低速离心，收集低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞；/n(3)向低速离心纯化后的中华乌塘鳢精巢细胞中加入中华乌塘鳢精子培养基和添加蛋白质添加剂进行重悬，接种到3D细胞培养皿中培养；/n(4)在3D培养过程中，利用免疫荧光检测其中的生殖细胞；每2-5天更换一半新鲜精子培养基，统计精子数量，曙红Y染色检测培养精子的存活率；/n(5)将3D培养产生的中华乌塘鳢精子与中华乌塘鳢成熟卵子进行体外受精，统计胚胎的受精率。/n
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