[发明专利]枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统有效
| 申请号： | 201910888889.4 | 申请日： | 2019-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN110628798B | 公开（公告）日： | 2022-09-27 |
| 发明（设计）人： | 王智文;刘丁玉;黄灿;辛国省;陈涛 | 申请（专利权）人： | 天津大学 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/10;C12N15/75;C12N9/22 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人： | 曹玉平 |
| 地址： | 300350 天津市津南区海*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | 本发明公开了枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9基因组编辑系统，该系统的构建方法为：1)构建质粒pBSCas9；2)构建质粒pDonor；3)构建构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；4)由pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9基因组编辑系统。本发明解决了目前枯草芽孢杆菌传统基因组编辑技术中存在的问题，不引入任何“负筛选”标记，构建了高效率、高精确度的CRISPR‑Cas9和CRISPR‑Cas9n基因组无痕编辑系统。且可实现单位点和多位点等不同类型的基因编辑操作，同时实现编辑流程的迭代编辑循环。 | ||
| 搜索关键词： | 枯草 芽孢 杆菌 crispr cas9 基因组 编辑 系统 | ||
【主权项】：
1.枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统的构建方法，其特征是包括如下步骤:/n1)由来源于质粒pCas9cur的Cas9基因，来源于质粒pHP13的氯霉素抗性基因及其启动子，质粒pEBS-cop1的复制子，质粒pUC18的复制子，枯草芽孢杆菌启动子P43和质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件构建质粒pBSCas9；所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；氯霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；质粒pEBS-cop1的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；质粒pUC18的复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQID NO.27所示；/n2)以pHP13为出发质粒，添加枯草芽孢杆菌启动子Pmanp和靶向复制子rep60的gRNA，并将原氯霉素抗性基因及启动子序列替换为来源于质粒pGRB的氨苄青霉素抗性基因及启动子序列构建质粒pDonor；所述枯草芽孢杆菌启动子Pmanp的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述靶向复制子rep60的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述氨苄青霉素抗性基因及启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述质粒pDonor的核苷酸序列如SEQ IDNO.30所示；/n3)由质粒pUC18上的复制子和氨苄青霉素抗性基因及其启动子组合区域序列，枯草芽孢杆菌启动子P43，构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；所述质粒pUC18的复制子和氨苄青霉素抗性基因及其启动子组合区域核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。/n4)由pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。/n
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