[发明专利]一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法在审
| 申请号： | 201910893553.7 | 申请日： | 2019-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN110564766A | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 陈瑞爱;黄梅;刘定祥;李延鹏;王楠楠;叶俊贤;罗琼;董楠;杨小云 | 申请（专利权）人： | 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/45 |
| 代理公司： | 44467 广州市科丰知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 龚元元 |
| 地址： | 526060 广东省肇庆市高新区创业路5*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一种全基因组表达载体pBR322‑DHN3的制备方法，包括如下步骤：步骤1：建立pBR322‑Base载体；步骤2：构建pBR322‑PNP质粒、pBR322‑PDP质粒、pBR322‑LPD3质粒；步骤3：回收片段PNP、片段PDP、片段LPD3；并将片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3连接得到全长DHN3‑A备用；步骤4：将步骤1所得pBR322‑Base载体为模板，扩增、纯化后制得带同源臂的质粒片段；步骤5：将步骤4得到的质粒片段与步骤3得到的DHN3‑A进行同源重组得到重组产物。本发明的方法其能够成功制备全基因组表达载体pBR322‑DHN3，无随机突变发生。 | ||
| 搜索关键词： | 质粒 表达载体 全基因组 质粒片段 制备 兽用生物制品 随机突变 同源重组 重组产物 同源臂 构建 扩增 备用 回收 成功 | ||
【主权项】：
1.一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤1：建立pBR322-Base载体，在pBR322载体上引入能够与DHN3全基因组进行同源重组的片段；所述片段上具有与DHN3全基因组的3’末端和5’末端对应的同源臂；/n步骤2：构建过渡载体；所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP的目的片段包括NP、MINI和P基因；所述质粒pBR322-PDP的目标片段包括P，PD1和PD2,PD3基因；所述质粒pBR322-LPD3的目标片段包括PD3和L1,L2,L3,L4基因；/n步骤3：构建DHN3全基因组DHN3-A；将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3进行酶切得到基因片段PNP、PDP和LPD3，将基因片段PNP、PDP和LPD3通过T4链接酶连接得到DHN3全基因组DHN3-A；/n步骤4：构建带同源臂的质粒片段；将步骤1中的pBR322-Base载体为模板进行PCR扩增得到带同源臂的质粒片段；/n步骤5：构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤4中的质粒片段和步骤3中的DHN3全基因组DHN3-A进行同源重组得到具有DHN3全基因组DHN3-A的质粒pBR322-DHN3；/nDHN3全基因组DHN3-A的序列如序列表SEQ ID NO：1；/nMINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt。/n
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