[发明专利]一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法

摘要

本发明涉及一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，首先重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His‑tag抗体捕获，对于色度信号，可直接再自然光源下用相机拍照，对于荧光信号，将试纸条放置于多功能成像仪中拍照，随后对图像进行分析及结果判定。本发明提供的方法利用噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白为荧光供体，以抗氯噻啉抗体偶联的胶体金颗粒为荧光受体，根据荧光内滤效应，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的检测。本发明灵敏度高、快速、简便、经济、实用性强，可以对小分子的定量、在线检测。

主权项

1.一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，其特征包括：/n第一步：重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His-tag抗体捕获，/n硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的抗His-tag抗体(4.0mg/mL)和羊抗鼠IgG抗体(1.0mg/mL)分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，以1μL/cm的速度喷在NC膜上。将NC膜在37℃下干燥1小时。将分析物抗体标记的胶体金溶液以34μL/cm的速度喷在结合垫(玻璃纤维垫，已用含1mg/mL BSA的PBS溶液处理)上。然后将处理好的NC膜，结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3.5mm宽，在室温下储存备用；加样：将75μL的样品与75μL的重组示踪物：SEQ ID No.1所示序列(含有4μg蛋白质，0.5％吐温20)混合，将混合物滴到样品垫上，并流过膜15分钟；/n第二步：NC膜上的双信号的检测，/n色度信号：将试纸条置于自然光源下，用相机直接拍照。/n荧光信号：将试纸条置于多功能成像仪中，设置激发波长为470nm，滤光片为535nm，用成像仪自带相机拍照。/n第三步：检测结果的分析及结果判定，/n方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均灰度/光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均灰度/光密度值，以校正后的灰度/光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；/n方法2：用肉眼直接观察在自然光源和多功能成像仪中拍摄的图像。相对阴性对照的结果：在自然光源下拍摄的图片，若T线区域颜色未变淡为阴性，若无条带则为阳性；在多功能成像仪中拍摄的图片，若T线区域未出现绿色荧光为阴性，若T线区域出现明显绿色荧光为阳性。/n