[发明专利]用于表达限制性内切酶KasI的甲基化保护菌株的筛选方法在审
| 申请号： | 201910969528.2 | 申请日： | 2019-10-12 |
| 公开（公告）号： | CN110643558A | 公开（公告）日： | 2020-01-03 |
| 发明（设计）人： | 张坤晓;许恒皓;葛绍勇;李伦;韩挺翰 | 申请（专利权）人： | 莫纳(连云港)生物科技有限公司;江苏海洋大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12Q1/689;C12Q1/10;C12R1/19 |
| 代理公司： | 32255 连云港润知专利代理事务所 | 代理人： | 刘喜莲 |
| 地址： | 222000 江苏省连云港市高新*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明是一种用于表达限制性内切酶KasI的甲基化保护菌株的筛选方法，该方法从菌株Haemophilus haemolyticus的基因组中使用甲基转移酶M.HhaI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.HhaI的基因；再经构建甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株，筛选、构建限制性内切酶KasI的重组表达菌株，最后重组表达质粒pBAD‑R.KasI转化感受态细胞进行筛选培养，获得限制酶KasI的重组表达菌株。本发明方法实现了限制酶KasI的高效重组表达；利用阿拉伯糖操纵子表达系统进行限制酶KasI的重组表达；抵抗限制酶KasI对宿主基因组DNA的酶切，筛选出的M.HhaI甲基化保护菌株同样可应用于其他具有类似识别位点的限制酶的重组表达。 | ||
| 搜索关键词： | 限制酶 重组表达菌株 甲基转移酶 重组表达 菌株 限制性内切酶 甲基化 筛选 构建 阿拉伯糖操纵子 重组表达质粒 感受态细胞 宿主基因组 特异性引物 表达系统 筛选培养 基因 基因组 识别位 酶切 抵抗 转化 应用 | ||
【主权项】：
1.一种用于表达限制性内切酶KasI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于，/n(1)甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株的建立/na、甲基转移酶M.HhaI基因的获取/n甲基转移酶M.HhaI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法，从菌株Haemophilus haemolyticus的基因组中使用甲基转移酶M.HhaI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.HhaI的基因；/nb、构建甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株/n将M.HhaI基因序列以酶切-连接的方式插入低拷贝表达载体pACYC184质粒中，连接产物转化进入克隆菌株DH5α并涂布于氯霉素抗性平板进行培养；/nc、甲基化保护菌株的筛选/n对转化后菌株进行甲基化保护程度的筛选；/nd、限制性内切酶KasI基因的获取/n限制酶KasI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库的方法，从菌株Kluyvera ascorbata的基因组中使用限制酶KasI基因的特异性引物获得限制酶KasI的基因；/ne、构建限制性内切酶KasI的重组表达菌株/n使用阿拉伯糖操纵子表达系统，将KasI基因序列以无缝克隆的方式插入pBAD表达质粒中，连接产物转化进入DH5α表达菌株并涂布于氨苄青霉素抗性平板进行培养；通过测序，确认重组质粒的构建成功后转化进入R.KasI特异性保护菌株[pACYC184-M.HhaI，Top 10]，构建限制酶KasI的重组表达菌株；/n(2)限制酶KasI的重组表达/n将测序正确的重组表达质粒pBAD-R.KasI转化感受态细胞[pACYC184-M.HhaI，Top10]，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得限制酶KasI的重组表达菌株；该菌株经扩大培养后，以阿拉伯糖诱导，获得限制酶KasI的重组蛋白，并确认细菌蛋白粗提液具有限制酶KasI的活性。/n
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