[发明专利]一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法

摘要

本发明公开了一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法，制备方法为：(1)PLL‑DSP基因载体的制备；(2)制备PLL‑g‑Cit‑g‑PDP；(3)制备PLL‑g‑Cit‑g‑CG‑TAT‑GG‑REDV；(4)制备PLL‑g‑Cit‑g‑MMPSP‑PEG；(5)制备获得一种逐级响应型双基因递送系统；本发明的逐级响应型双基因递送系统，具有优异的体内长循环性能、内皮细胞靶向功能、内涵体逃逸性能及可控的基因释放功能，并共递送pZNF580和peNOS至内皮细胞。该递送系统由于其表面的PEG外层屏蔽作用，具有优异的血液稳定性。可有效递送治疗型基因至内皮细胞，促进增殖、迁移、血管化并缓解炎症。

主权项

1.一种逐级响应型双基因递送系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)PLL-DSP基因载体的制备；/n由Lys-Cbz制备Lys-Cbz-NCA；/n将Lys-Cbz-NCA溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入己胺作为引发剂，室温下，开环聚合反应，置于截留分子量6000-8000Da的透析袋中用蒸馏水透析，冷冻干燥，制得PZLL；将PZLL溶解于三氟乙酸中，并加入33wt％的HBr的HAc溶液，室温下，进行脱保护反应，用无水乙醚沉淀出粗产物，透析，冷冻干燥，获得PLL；将PLL溶解于pH＝7.2-7.4的PBS溶液，向溶液中滴入DSP交联剂的二甲基亚砜溶液，室温下搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用蒸馏水进行透析，冷冻干燥，制得PLL-DSP粉末；/nLys-Cbz为N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的简写；/nLys-Cbz-NCA为N(ε)-苄氧-L-赖氨酸环内酸酐的简写；/nPZLL为聚-N(ε)-苄氧羰基赖氨酸的简写；/nPLL为聚-L-赖氨酸的简写；/nDSP为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的简写；/nPLL-DSP为DSP交联的聚-L-赖氨酸的简写；/n(2)将SPDP溶解于甲醇中，滴加至ε-PLL的PBS溶液中，室温搅拌反应12-24h，冷却至0℃，加入氢氧化钠水溶液调整溶液pH值至8-9，再滴加柠槺酸酐，ε-PLL与SPDP、柠槺酸酐的质量比为1:(0.1-0.5):(1-3)，滴加过程中不断补充氢氧化钠水溶液，使得pH保持在8-9之间，待溶液pH值不再发生变化时，再继续搅拌12-24h，用pH在8-9之间的蒸馏水透析，冷冻干燥获得PLL-g-Cit-g-PDP；/n所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；/nSPDP为3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的简写；/nε-PLL为ε-聚-L-赖氨酸的简写；/nCit为柠槺酸酐的简写；/nPLL-g-Cit-g-PDP为柠槺酸酐和SPDP共修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的缩写；/n(3)将REDV-GG-TAT-GC多肽的PBS溶液，滴加至步骤(2)制得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，PLL-g-Cit-g-PDP与REDV-GG-TAT-GC的质量比为1:(0.5-1)，室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9之间的蒸馏水进行透析，冷冻干燥，获得PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV；/n所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝8.0-9.0；/nPLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV为REDV和TAT共同修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；/n所述REDV-GG-TAT-GC多肽的氨基酸序列用SEQ ID NO.1所示；/n(4)将GPLGLAGC的PBS溶液滴入步骤(2)获得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，室温搅拌12-24h，得反应液，再将NHS-PEG-OMe加入反应液中，继续室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9蒸馏水进行透析，冷冻干燥，制得PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG；/n所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；/nGPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列，简写为MMPSP；/nNHS-PEG-OMe为一端带有-N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇单甲醚的简写；/nPLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG为基质金属蛋白酶敏感的PEG修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；/n(5)将步骤(1)制备的PLL-DSP溶解在PBS溶液，得到第一溶液；向第一溶液中加入pDNA溶液，PLL-DSP与pDNA的质量比为(3-5)：1，涡旋混匀并室温孵化，得到二元基因复合物溶液；将步骤(3)制备的PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV和步骤(4)制备的PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG按质量比1：1均匀分散在PBS溶液，得到第二溶液；向二元基因复合物溶液中加入第二溶液，PLL-DSP的质量与PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV和PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG的总质量的质量比为1：(1-2)，涡旋混匀并室温孵化，获得四元基因复合物溶液，即为一种逐级响应型双基因递送系统；/n所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝7.2-7.4。/n