[发明专利]一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株及应用有效
申请号: | 201911210535.0 | 申请日: | 2019-12-02 |
公开(公告)号: | CN110734865B | 公开(公告)日: | 2022-11-01 |
发明(设计)人: | 刘浩;曹威;单璐;黄和;徐晴 | 申请(专利权)人: | 南京昊禾生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N1/15 | 分类号: | C12N1/15;C12P7/46;C12R1/685 |
代理公司: | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人: | 韩晓梅 |
地址: | 210013 江苏省南*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明涉及一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株,步骤如下:获得pexG基因敲除菌株S914;获得表达苹果酸合酶基因mas*菌株S1016;过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白基因dct1,经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得无筛选标记的过表达dct1菌株S1140,即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。本菌株基于黑曲霉耐酸且产生有机酸的天然特性,通过遗传重组改造黑曲霉的生理特性而获得的,经过实验证实,该黑曲霉基因工程菌株在低pH下生产苹果酸的能力显著提升,为微生物发酵法制备苹果提供了优良菌种。 | ||
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【主权项】:
1.一种低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株,其特征在于:所述基因工程菌株的构建步骤如下:/n步骤1:敲除过氧化物酶体上与异柠檬酸裂解酶相对应的Peroxins蛋白基因pexG,该蛋白能将定位于过氧化物酶体的异柠檬酸裂解酶转运至过氧化物酶体基质;首先,以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经PCR扩增黑曲霉pexG基因上下游同源臂序列片段,所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为SEQ NO.1,SEQ NO.2,长度分别为1207bp、1139bp;然后分步将上下游同源臂序列片段经过EcoR I、BamH I和Xba I、Pst I双酶切回收克隆到载体pLH594,构建基因pexG敲除质粒pLH692;将所述质粒pLH692转化至黑曲霉宿主菌株,经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得pexG基因敲除菌株S914;/n步骤2:过表达苹果酸合酶基因mas*,首先通过设计引物将苹果酸合酶基因mas的过氧化物酶体定位序列即其C-端三个氨基酸突变为终止密码子TAA,用该引物以黑曲霉cDNA为模板进行扩增,获得mas*基因序列片段,所述基因mas*序列片段的核苷酸序列为SEQ NO.3,长度为1797bp;然后将该片段经过EcoR I和BamH I双酶切回收克隆到载体pLH454,构建基因mas*表达质粒pLH695;所述基因mas*序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制,将所述质粒pLH695转化至黑曲霉S914宿主菌株,经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达mas*基因菌株S1016;/n步骤3:过表达黑曲霉苹果酸转运蛋白dct1,将表达黑曲霉转运蛋白基因dct1表达质粒pLH455转化至黑曲霉S1016宿主菌株,经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得表达dct1基因菌株S1140,即为低pH条件下高产苹果酸的黑曲霉基因工程菌株。/n
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