[发明专利]胰岛素前体基因在酵母中的分泌表达和人胰岛素的制备

摘要

本发明为一种用单链胰岛素前体基因在酵母中分泌表达和人胰岛素的制备方法，包括基因合成，表达质粒和工程菌构建及表达产物的分离纯化和转化成结晶人胰岛素等。猪胰岛素单链前体表达量达４０—５０ｍｇ／Ｌ，转化为结晶人胰岛素达１５—２０ｍｇ／Ｌ，并能不断提高，本发明可发展成为基因工程人胰岛素生产的工业体系。

主权项

1.一种在酵母中分泌表达猪单链胰岛素前体(PSCI)基因并用此表达产物制备人胰岛素的方法，包括它的PSCI基因合成，编码酵母α-交配因子前导序列的DNA片段的制备，PVT102-U/α-MFL-PSCI质粒和pPGK/PSCI质粒的构建，用上述质粒转化酵母菌而得到工程菌YS-90及YS-91，以及分泌表达产物PSCI的分离纯化及转化为人胰岛素的转肽条件等，其特征在于：a.使用了由化学合成的DNA片段，用T4DNA连接酶连接成175bp左右的大片段DNA(PSCI基因)，其序列如下：LDKRFVNQHLCGSHLVCTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTT.GGTT-TATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAA-CCAA-EALYLVCGERGFFYTPG-AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT.TCTACACTC-CT-C.TTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAGA-AGATGTGAG.GA-KAAKGIVEQCCTSICSAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACCTCCATCTG-CTCC-TTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGG-AGGTAGAC.GAGG-LYQLENYCNTTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTTCGA这个片段含有Leu，Asp和Arg的密码子和猪单链胰岛素前体基因，在基因的5’端和3’端有XbaI和HindIII酶切位点的粘性末端；PSCI为猪B1-30-Xn-Y-猪A1-21，其中X为除Lys或Arg以外的任一天然氨基酸，Y为Lys或Arg，n＝1-15；b.将a中所述的PSCI基因克隆到质粒pVT102-U/α-MFL中，得到PSCI基的分泌表达质粒pVT102-U/α-MFL-PSCI，使用醇脱氢酶1启动子(ADHp)和醇脱氢酶1终止序列(ADHt)；c.使用磷酸甘油激酶启动子(PGKp)代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp，构建成分泌表达质粒pPKG/PSCI；d.编码酵母α交配因子前导序列(α-MFL)的DNA片段，用聚合酶链式反应(PCR)由酵母总DNA为模板复制获得，得到的PCR产物为具有下列改变的编码α-MFL的DNA片段；GGATCCATGAGATTTCCTTCA---------AAAGAAGAAGGGGTATCTCTAGACCTAGGTACTCTAAAGGAAGT---------TTTCTTCTTCCCCATAGAGATCT与原来α-MFL顺序相比较，在碱基No.1的前面加上了BamHI的位点；亮氨酸的密码TTG(碱基No.244-246)改为CTA，和前面的GA形成XbaI位点。e.选用酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae(XV-700-6B)和b中所述的表达质粒pVT102U/α-MFL-PSCI构建成工程菌SaccharomycescerevisiaeYS90，PVT102U/α-MFL-SCI(XV-700-6B)；f.选用酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae(XV-700-6B)和c中所述的表达质粒pPKF/PSCI构建成工程菌SaccharomycescerevisiaeYS91，pPGK/SCI(XV-700-6B)。