[发明专利]一种人白细胞介素-2的基因合成表达质粒的构建及产物的生产工艺

摘要

白细胞介素-2是作为一种免疫药物可用于治疗某些病毒性疾病和癌症，有很好的应用前景，临床需要量很大，是国际上竞相开发的产品。本发明是通过构建带有天然白细胞介素-2基团的表达质粒，在大肠杆菌中高效表达，表达量达菌体总蛋白的30—40％。本发明还建立了一个高效的包涵体分离技术和获得高比活的白细胞介素-2纯化方法，这为大量生产白细胞介素-2创造了很好的条件。

主权项

1、一种人白细胞介素-2(IL-2)基因的合成及表达质粒的构建，其特征是：(a)使用人工设计、化学合成的基因，基因结构式如下：AATTCTTATGGCTCCGACTTCTTCTTCTACTAAAAAGACTCACMetAlaProThrSerSerSerThrLysLysThrGlnCTTCAGCTGGAACATCTGCTGCTGGACCTCCAGATGATCCTGAACLeuGlnLeuGluHisLeuLeuLeuAspLeuGlnMetIleLeuAsnGGTATCAACAACTACAAAAACCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCGlyIleAsnAsnTyrLysAsnProLysLeuThrArgMetLeuTnrTTCAAATTCTACATGCCGAAAAAAGCTACCGAACTGAAACATCTGPheLysPheTyrMetProLysLysAlaThrGluLeuLysHisLeuCAGTGCCTTGAAGAAGAACTGAAACCGCTGGAAGAAGTTCTGAACGlnCysLeuGluGluGluLeuLysProLeuGluGluValLeuAsnCTGGCTCAGTCTAAAAACTTCCATCTGCGTCCGCGTGACCTGATCLeuAlaGlnSerLysAsnPheHisLeuArgProArgAspLeuIleTCTAACATCAACGTTATCGTTCTGGAACTGAAAGGTTCTGAAACCSerAsnIleAsnValIleValLeuGluLeuLysGlySerGluThrACCTTCATGTGCGAATACGCTGACGAAACCGCTACCATCGTTGAGThrPheMetCysGluTyrAlaAspGluThrAlaThrIleValGluTTCCTGAACCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCTATCATCTCTACCPheLeuAsnArgTrpIleThrPheCysGlnSerIleThrPheCysGlnSerIleIleSerThrCTGACCTGATAGGATCLeuThrTermTermIL-2由133个氨基酸组成，合成的该基因有399bp，加上起始密码子ATG，终止密码子TAG和TGA及5′和3′末端克隆用的限制性内切酶切点，共有421bp，选用了大肠杆菌使用频率高的密码子，使合成的IL-2基因能在大肠杆菌中高效表达，产生大量的人IL-2，而不改变IL-2的氨基酸顺序；(b)将合成的IL-2基因克隆入带有PL启动子CIts857温控阻遏蛋的基因、核糖体5SrRNA基因终止信号t1t2和MCS区的基因载体pLy-4中，构建成IL-2的表达质粒Ply4-IL-2，转化大肠杆菌后获得高效表达；转化后的工程菌为大肠杆菌EscherichiacolSIB-203-1pLy4-IL，保藏编号：CCTCCNO.(中国典型培养物保藏中心.中国.武汉.珞珈山武汉大学校内)；(c)表达产物以包涵体的形式存在，得包涵体产物后用8M盐酸胍溶解，上SephacrylS-200柱，一步柱层析可以得到纯度＞95%，比活＞2×106Boehringer单位/毫克蛋白的IL-2，相当于1.2×107国际单位/毫克蛋白的IL-2；