[发明专利]以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法

摘要

用叶绿素分子（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）作为连接子把蛋白质等生物活性分子与核酸共价交联来构建的基因探针，可广泛地应用于分子生物学研究、生化分析、临床检测等生命科学研究与应用的各个领域。由此法构建基因探针具有操作简便，稳定性好，成本低廉，易于长期保藏等特点，是一种应用前景广泛的生命科学研究工具。$#!

主权项

1．以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法，其中之一为蛋白质基因探针，蛋白质包括抗原、抗体、多肽、激素，其特征在于该方法包括两个必需的步骤：首先是利用叶绿素分子中的酯键与经特异性限制性核酸内切酶作用后的双链DNA分子中的游离氨基反应形成酰胺键，从而将叶绿素分子定向地共价结合在双链DNA分子上；其次是通过叶绿素分子的极性头部在一定波长和强度的光激活下与蛋白质共价交联，形成蛋白质-DNA的基因探针；该方法的全部步骤罗列如下：第1步用分析纯的无水乙醇提取纯化植物叶片总叶绿素分子；第2步用碱变性法提取纯化质粒pNC3DNA分子；第3步取10μgpNC3DNA溶于60μl反应体积的反应液中，加入EcoRI2u／μgDNA，在温度为37℃的环境中反应2-3小时，使EcoRI酶切pNC3DNA分子，直到消化完全；第4步用等体积按酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的比例混合的PH值为7．8-8．0的有机溶剂溶液抽提第3步制备的反应液一次，在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟；第5步取第4步制备的水相，按水相体积∶总叶绿素分子乙醇溶液体积为2∶1的比例，在其中加入第1步中提取纯化的总叶绿素分子乙醇溶液，轻轻混合，在温度为50℃的避光环境中反应15分钟；第6步在第5步制备的溶液中加入等体积的分析纯的异丙醇，在温度为0℃的避光环境中保持10分钟；第7步将第6步制备的溶液在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心10分钟，弃去上清液；第8步向第7步制备的溶液中加入70％乙醇，然后在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟，弃去上清液；第9步将第8步制备的溶液在避光环境中快速真空干燥20-30分钟；第10步在第9步制备物中加入PH值为7．2的PBS缓冲液5-10μl，温和摇荡几次，使沉淀完全溶解；第11步在第10步制备的溶液中加入按蛋白质：DNA的克分子数的比例为2∶1的抗原或抗体，在温度为37℃的黑暗环境中反应10分钟；第12步在第11步制备的溶液中加入1M的PH值为6．5的醋酸钾，使溶液的PH值为6．8，在温度为37℃的黑暗环境中反应30分钟；第13步置第12步制备的反应液于强度为50000-80000Lux波长入为400-700nm的光下反应5分钟；第14步在第13步制备的反应液中加入1MNaHCO3溶液，使溶液PH值为7．2-7．4，最终体积为20μl，即得蛋白质-DNA基因探针；第15步保藏备用。