[发明专利]重组人肝细胞生成素的生产方法及其治疗严重肝病的用途

摘要

本发明为重组人肝细胞生成素（ｒＨＰＯ）的生产方法及其治疗严重肝病的用途；属生物产品生产方法及用途领域。在获取ｈＨＰＯｃＤＮＡ并成功构建高效表达菌株的基础上,建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质纯化和复性工艺，以获得重组人肝细胞生成素纯品；其生物特征为等电点７．２，分子量１５２８０道尔顿；在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖，在体内能促进１／３肝部分切除后及ＣＣｌ4致损后大鼠肝细胞ＤＮＡ合成，并能阻止肝细胞坏死，显著提高CCl4诱导肝功能衰竭大鼠存活率，表明rHPO有可能是临床治疗严重肝病的有效药物。

主权项

1.一种重组人肝细胞生成素(rHPO，原名肝增殖素)的生产方法，其特征为：a：HPO工程菌低密度发酵后，经包涵体变性，采用复性溶液，其组分为：2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/LTrisHCl，pH8.0或稀释复性溶液，其组分为：100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽、100mmol/LTrisHCl，pH8.0复性；b：复性蛋白的柱层析纯化采用SPFF阳离子交换柱，上样后乙酸钠缓冲液洗脱未结合相，用300mmol/LNaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰：DEAESepharoseFF(Pharmacia)阴离子交换柱用50mmol/LTrisHCl，pH8.0缓冲液洗脱未结合相，用350mmol/LNaCl阶段洗脱，rHPO在第一峰；c：包涵体变性条件下柱层析为：AcA44凝胶过滤柱上样后用2mol/L盐酸胍洗脱，rHPO在第二峰中；MONOQ离子交换层析上样后用0.05mol/LNH4Ac配制的0.05mol/LNaCl将rHPO洗脱下来，rHPO在主峰中；d：所生产的rHPO具有以下生物学特征：具有附图1氨基酸序列，等电点为7.2，分子量为15280道尔顿；在体外能促进原代培养肝细胞及肝癌细胞的增殖，在体内能促进1/3肝部分切除后及CCL4致损后大鼠肝细胞DNA合成，并能阻止肝细胞坏死，显著提高CCL4诱导肝功能衰竭大鼠存活率。