[发明专利]抗肝癌单克隆抗体HAb25及其单链抗体和双功能抗体

摘要

抗肝癌单克隆抗体HAb25及其基因工程单链抗体和双功能抗体,主要涉及基因工程技术。其主要技术特征是,首先利用杂交瘤技术制备出对人肝癌细胞具有特异结合活性的鼠源性单克隆抗体HAb25;进而通过基因工程技术将HAb25改造构建成抗肝癌单链抗体scFv25和抗肝癌双功能抗体pBV220－scFv25-PE40、pGEX4T－1－scFv25－TNFa。抗肝癌基因工程抗体具有分子量小、穿透能力强、分子稳定性好、毒副作用低、效力高和容易通过基因工程大量生产等特点,具有很大的临床应用潜力。

主权项

1.抗肝癌单克隆抗体HAb25及其单链抗体和双功能抗体，其特征在于：(1)抗肝癌单克隆抗体HAb25：以外科手术切除的新鲜的原发性肝细胞肝癌标本制备的肝癌细胞悬液为免疫原免疫BALB/C小鼠。将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，获得杂交瘤细胞，杂交瘤细胞用免疫组织化学方法筛选，得到可持续分泌抗体的抗肝癌单克隆抗体HAb25杂交瘤细胞株，将该细胞株接种于小鼠腹腔，收集腹水，腹水内蛋白经硫酸胺沉淀和阳离子常压液相色谱纯化，获得HAb25活性蛋白。(2).抗肝癌单链抗体(scFv25)：①HAb25轻、重链可变区基因(VL，VH)的克隆：从上述杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR法扩增出单克隆抗体HAb25的轻、重链可变区基因，经分析是重排的IgV区基因。②抗肝癌单链抗体scFv25的构建：先将人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆载体，构建成pUC19-Linker，进一步将VL克隆入pUC19-Linker，构建成pUC19-Linker-VL，再将VH克隆入pUC19-Linker-VL，构建成pUC19-VH-Linker-VL，即重组抗肝癌单链抗体克隆载体pUC19-scFv25，然后将scFv25亚克隆入pET15b，构建成分子量只有全抗体1/6的抗肝癌单链抗体的重组原核表达载体pET15b-scFv25。③pET15b-scFv25的诱导表达：重组pET15b-scFv25原核表达载体宿主菌经IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→进一步纯化，获得抗肝癌单链抗体scFv25活性蛋白。(3)抗肝癌双功能抗体：①抗肝癌单链免疫毒素(scFv25-PE40)的构建、表达：将PE40基因克隆入pUC19-scFv25中，构建成pUC19-scFv25-PE40重组抗肝癌单链免疫毒素克隆载体，然后再将scFv25-PE40亚克隆入原核表达载体pBV220中，构建成pBV220-scFv25-PE40，即重组抗肝癌单链免疫毒素原核表达载体pBV220-scFv25-PE40。上述载体宿主菌经42℃诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→进一步纯化，获得抗肝癌单链免疫毒素scFv25-PE40活性蛋白。②抗肝癌双功能抗体(scFv25-TNFα)的构建、表达：将TNFα基因克隆入pUC19-scFv25中，构建成pUC19-scFv25-TNFα重组抗肝癌双功能抗体克隆载体，然后再将scFv25-TNFα亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中，构建成pGEX4T-1-scFv25-TNFα，即重组抗肝癌单链双功能抗体原核表达载体pGEX4T-1-scFv25-TNFα。上述载体宿主菌经IPTG诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→GST亲和层析纯化→凝血酶消化和进一步纯化，获得抗肝癌双功能抗体scFv25-TNFα活性蛋白。