[发明专利]以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1

摘要

以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1,涉及基因工程技术,采用全合成Tα1基因的方法,通过克隆、测序等步骤,把Tα1基因串联为四聚体,并利用大肠杆菌加以表达,采用离子交换法加以纯化,从而获得高纯度、高活性的Tα1生物活性物质,且生产工艺简单、成本低、产量大,其市场需求将不可估量。

主权项

1.以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1，其特征是：首先按照大肠杆菌的惯用密码子把的Tα1的28个氨基酸转化为以下核苷酸序列：5′AGCGACGCCGCCGTGGACACCAGCAGCGAGATCACCACCAAG3′TGCCTGCGGCGGCACCTGTGGTCGTCGCTCTAGTGGTGGTTCGACCTGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTGGAGGAGGCCGAGAAC3′CTGGACTTCCTCTTCTTCCTCCACCACCTCCTCCGGCTCTTG5′然后在Tα1基因前依次接上核酸内切酶(EcoRI)，蛋氨酸、核酸内切酶(BamHI)、蛋氨酸对应的核苷酸序列，在Tα1基因后依次加上蛋氨酸、核酸内切酶(Bg1II)、终止密码子、核酸内切酶(PstI)对应的核苷酸序列。把pUC19用EcoRI和PstI双酶切，然后把退火过Tα1基因连同其前后的附加序列用T4DNA连接酶与pUC19/EcoRI+PstI连接后，克隆入pUC19的EcoRI和PstI位点，酶切、测序证明正确的克隆经扩大培养后，提取质粒，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约120个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2698个核苷酸残基)，再把两份回收的大、小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的2串体。经酶切和测序证明正确的2串体克隆，经扩大培养，提取质粒DNA，分为两份，一份用BamHI+PstI双酶切，回收小片段(约240个核苷酸残基)，一份用Bg1II+PstI双酶切，回收大片段(约2930个核苷酸残基)，大小片段用T4DNA连接酶连接，即为Tα1的4串体。上述克隆技术路线如下：EcoRIMetBamHIMetTα1基因MetBg1IIstopPstIAATTCATGGGATCCATG————ATGAGATCTTCACTGCA采用BanHI和Bg1II酶切后实现Tα1基因的串联。