[发明专利]抗幽门螺杆菌免疫禽蛋的生产方法

摘要

本发明涉及抗幽门螺杆菌免疫禽蛋的生产方法将含幽门螺杆菌尿素酶基因UreA或UreB在大肠杆菌中的表达产物经分离纯化得幽门螺杆菌尿素酶α-亚基和β亚基，分别用磷酸钾缓冲液稀释，再加入等体积F氏完全佐剂，经超声混匀的定量混合液，给当年产蛋家禽进行胸肌注射，两周后产的蛋即为抗幽门螺杆菌免疫禽蛋，口服该蛋卵黄可有效抑制人胃中幽门螺杆菌尿素酶活性，抑制和消除其在胃中生产和繁殖，达到预防治疗活动性胃炎及消化性胃溃疡等病症。

主权项

1.抗幽门螺杆菌免疫禽蛋的生产方法，其特征在于步骤如下：a.制备免疫抗原构建含有幽门螺杆菌尿酶结构基因ureA或ureB的表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化，制备幽门螺杆菌尿素酶α亚基或β亚基。a-1.UreA基因的PCR扩增、克隆、表达产物及分离纯化制备幽门螺杆菌尿素酶α亚基：(1)PCR引物设计用一对PCR引物：5’-CATCC(G，A，C，T)AA(A，G)GA(A，G)(C，T)T(G，A，C，T)GA(C，T)AA(A，G)(C，T)T(G，A，C，T)ATG-3’5’-(C，T)TC(C，T)TT(G，A，C，T)CG(G，A，C，T)CG(G，A，C，T)(G，C)(A，T)(G，A，T)AT(C，T)TT(C，T)TTCATCTA-3’扩增长度为0.8Kb的UreA全长基因(2)模板DNA制备a.取用临床胃溃疡病人的胃镜检组织作为PCR扩增模板，用生理盐水冲洗数次。b.加入50μl裂介液，并同时加入蛋白酶K10μg。c.50℃水浴4小时d.100℃水浴10分钟e.离心10000转5分钟，取上清10μl进行PCR扩增裂介液配制：10mmol/LTris-HclpH8.350mmol/Lkcl0.45％NP400.45％Tween202.5mmol/LMgCl2(3)PCR扩增反应PCR扩增反应使用100μlPCR反应体积PCR扩增反应含：10×PCR缓冲液10μl2.5mmol/LdNTP4μlTag酶4单位PCR引物各200ng模板DNA10μl-------------------------------------------加水至100μlPCR反应扩增条件：94℃5分钟预变性94℃30秒变性60℃1分钟退火72℃1分30秒链延伸共反应35个循环72℃5分钟结束反应10×PCR缓冲液配制：100mmol/LTris-HclpH9.0500mmol/Lkcl1％TritonX1002％Tween2015mmol/LMgCl2(4)PCR扩增产物回收和克隆用1％琼脂糖凝胶进行电泳溴化乙碇染色并在紫外灯下检测，用凝胶回收试剂盒从胶中回收0.8kb的PCR扩增产物，即UreA基因质粒。pBluescriptIISK+用SmaI酶切，与PCR产物UreA基因以1∶2的比例平端进行连接，12℃连接过夜。用连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选氨苄抗性菌落。提取阳性重组质粒DNA，并进行DNA测序分析，选择DNA序列正确的重组质粒进行下述步骤(5)重组质粒亚克隆及表达表达载体pTRC99A用EcoRI和BamHI双酶切与上述得到的重组质粒用EcoRI和BamHI双酶切插入片段连接，12℃直接过夜。用连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选氨苄抗性菌落。将上述阳性菌落接种LB液体培养基，37℃培养10小时后，加入IPTG诱导表达16小时后，即可进行表达产物的鉴定和分离纯化。(6)表达产物尿素酶α亚基的鉴定及分离纯化经IPTG诱导表达的LB培养表达液1ml，4000转离心1分钟，取沉淀下来的菌体进行12％SDS-PAGE电泳分析鉴定。菌体悬浮在缓冲液A中，并加入溶菌酶4mg/ml室温反应15分钟，加入等体积的缓冲液B室温振荡1小时，15000转离心10分钟，取上清，加入硫酸铵0.3g/ml迅速搅拌，15000转离心10分钟，收集得到幽门螺杆菌尿素酶α亚基沉淀物，即为幽门螺杆菌尿素酶α亚基表达产物粗提物，通过BioRex柱层析进一步纯化获得该表达产物精提物。缓冲液A配制：50mmol/LTris-HclpH7.950mmol/Ldextrose1mmol/LEDTA缓冲液B配制：10mmol/LTris-HclpH7.950mmol/Lkcl1mmol/LEDTA1mmol/LPMSF0.5％Tween200.5％NP40a-2.UreB基因的PCR扩增、克隆、表达及产物分离纯化制备幽门螺杆菌尿素酶β亚基(1)PCR引物设计用一对PCR引物：5’-ATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATG-3’5’-CTTACGAATAACTTTTGTTGCTTGAGC-3’扩增长度为1.8kb的UreB全长基因(2)模板DNA制备与a-1(2)相同(3)PCR扩增反应PCR扩增反应使用100μlPCR反应体积PCR扩增反应含：10×PCR缓冲液10μl2.5mmol/LdNTP6μlTag酶8单位PCR引物各200ng模板DNA10μl---------------------------------加水至100μlPCR反应扩增条件：94℃5分钟预变性94℃30秒变性60℃1分钟退火72℃3分钟链延伸，共反应35个循环72℃5分钟结束反应(4)PCR扩增产物回收和克隆与a-1(4)相同(5)重组质粒亚克隆和表达与a-1(5)相同(6)表达产物尿素酶β亚基的鉴定及分离纯化其方法与步骤与a-1(6)相同b.将上述得到的100μg-500μg幽门螺杆菌尿素酶α-亚基或β-亚基或两种亚基按重量比1∶1混合作为免疫抗原，用0.01mol/L磷酸钾缓冲液PH＝7.2稀释后，加入等体积的F氏完全佐剂，经超声混匀制成混合液；C.在当年产蛋家禽胸肌上分两点或多点注射上述混合液，12天后再同剂量加强注射一次；d.免疫注射两周后开始收蛋，此蛋即为抗幽门螺杆菌免疫禽蛋。