[发明专利]人源含硒抗体酶的制备方法

摘要

本发明属于人源含硒抗体酶的制备方法。本发明利用S－二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯作为半抗原,从人源噬菌体展示的单链抗体库中筛选得到半抗原特异的单链抗体,化学修饰在大肠杆菌中利用突变引物高效表达的特异抗体,将催化基团引入到抗体的活性部位,成功获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶活力的人源含硒抗体酶。本发明提供的人源含硒抗体酶制备方法具有技术先进,产量高,成本低的特点,有明显的临床应用潜力。

主权项

1.一种人源含硒抗体酶的制备方法，其特征在于具体制备步骤有以下四步：I.半抗原的设计与合成系列半抗原结构如下：R＝-C4H9，-C6H11，-CH2(C6H5)，-CH(CH3)2，-CH2CH2CH(CH3)2取0.8-1.2g谷胱甘肽与2，4-二硝基氯苯在10℃反应，得到S-二硝基苯取代的谷胱甘肽，将0.1-0.5gS-二硝基苯取代的谷胱甘肽加入2-5ml相应的醇：正丁醇或异丙醇或苄醇或正己醇或异戊醇，冰浴，通入过量的干燥氯化氢至饱和，在4-20℃放置5-80hr，反应结束后，产物用乙醚洗涤，干燥，即为系列半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯；II.半抗原特异的人单链抗体基因的筛选用10-40μg/ml半抗原包被免疫平皿，加入人噬菌体展示的单链抗体库，15-37℃温浴2hr，0.05M，PH7.2的磷酸钠缓冲液洗平皿，加入0.5-2.5ml，20-150mmol/L的三乙胺，20-40℃放置8-15min，用0.4-1.0ml，0.5-1.2mol/L，PH7.0-8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中和洗脱液，洗脱下的噬菌体加入到OD值为0.2-1.0的5-15ml的大肠杆菌TG1中，于20-40℃侵染25-40min，在含100μg/ml的氨苄青霉素和1％的葡萄糖的2×TY中扩大培养TG1，利用野生的噬菌体M13K07捕获特异噬菌体，重复以上过程3-6次，酶联免疫法检测筛选得到的特异噬菌体抗体；III.人原单链抗体的高效表达、复性及纯化提取特异抗体基因，测序，在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因序列设计突变引物，扩增抗体基因，利用NdeI/HindIII酶切位点将抗体基因组装到pET21a表达载体上，获得了以包含体形式高效表达的单链抗体，将从1L培养物中收获的菌体重悬于PH8.0，含有2mMβ-巯基乙醇和0.01％溶菌酶的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中，超声破碎菌体，12000rpm离心20分钟，沉淀即为包含体，包含体经2M氯化钠溶液，0.5％TritonX-100和4M尿素洗涤后，溶于3-12ml，含6M盐酸胍，PH为7.0-9.0，10-50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐变性液中，用BIO-RAD公司的蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，在50ml含0.2-1.0M精氨酸，1-5mM乙二胺四乙酸，1-3M盐酸胍的0.1-0.8M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐复性液中滴加变性蛋白溶液，每隔0.5-2.5hr滴加一次，共滴加3-8次，0-12℃放置过夜，浓缩、透析除去盐酸胍，冻干，冻干的蛋白干粉溶于PH7.0-9.0，10--50mM的磷酸钠缓冲液中，经葡聚糖凝胶SephadexG-75分离纯化，收集主峰，即为单链抗体纯品；IV.催化基团的引入把0.4-1.2×10-5mmol/L单链抗体纯品，溶于无氧水中，加入2.0-5.0×10-5mmol/L苯甲基磺酰氟，15-30℃振荡1-3hr，在氮气保护下加入0.5-2.5×10-4mol/L硒氢化钠溶液，30-40℃保温25-40hr，反应液经葡聚糖凝胶SephadexG-10除盐后，即得具有谷胱甘肽过氧化物酶活力的人源抗体酶。