[发明专利]甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录－聚合酶链反应检测法

摘要

本发明是一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录一聚合酶链反应检测法。该法选用编码甲肝病毒结构蛋白3羧基端的基因区为目标区，设计合成引物，并严格的运用逆转录一聚合酶链反应技术对甲肝活疫苗的滴度进行检测。该技术的检测灵敏度与组织培养半数感染量相仿，但时间可从1个月缩短为一天，具有快速、简便、灵敏、特异的特点，可用于甲肝活疫苗的常规检测及质量控制。该技术还可应用于甲肝病毒的临床诊断，实验室诊断和流行病学调查。

主权项

1、一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录一聚合酶链反应检测法，其特征在于包含以下几个步骤：①引物设计参考甲型肝炎病毒核苷酸序列，选择编码甲型肝炎病毒结构蛋白3羧基端的基因区为目标区，设计合成引物，②甲肝疫苗的处理甲肝疫苗数支混合，取1ml加入1.5ml离心管中加入聚乙二醇和氯化钠，3℃～8℃沉淀2小时以上，离心，去除上清，沉淀用溶解液溶解，③逆转录-聚合酶链连反应用溶解液10倍稀释已溶解的疫苗病毒至10-1，10-2……，每个稀释度各做4管，反应条件：1ul样品，2ul10×聚合酶链缓冲液，4ul氯化镁，3.2ul二乙基焦碳酸盐处理的水，4×2ul10umol/1脱氧核苷，负链引物2ul，97℃作用5分钟，再加入核糖核酸酶抑制剂0.5ul，M-MLV逆转录酶0.2ul，混匀后在42℃作用45分钟，99℃5分钟，然后，在上述反应管中加入4ul氯化镁，8ul10×聚合酶链缓冲液，Tag酶0.5ul，正链引物2ul，补双蒸水至100ul，混匀后覆盖液体石蜡50ul，然后进入聚合酶链循环，共循环30周～35周，④电泳检测取10ul聚合酶链反应产物，1.5％琼脂糖电泳检测，⑤逆转录-聚合酶链阳性的判断甲肝疫苗经逆转录-聚合酶链反应，琼脂糖电泳后，在约200bP处肉眼可见-电泳带的为阳性，⑥获得甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录-聚合酶链反应值，以1ml疫苗的总病毒为1，经逆转录-聚合酶链反应值的计算，得甲肝减毒活疫苗滴度值。