[发明专利]人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法

摘要

一种人胎盘泌乳素诊断试剂的制备方法，是应用免疫学原理，从人胎盘提取HPL，经两次亲和层析后获得高纯度的HPL，分别制成诊断血球和扩散板，本发明的HPL纯品为单一成份，无非特异性，并与HPL抗血清有免疫反应，而与抗HCG、抗AFP、抗人全血清无免疫反应，应用本发明，方法简单，操作方便，性能稳定，结果准确，一般实验室均可操作，在临床上对妊娠高血压综合症、胎儿发育迟缓、死胎、过期妊娠等异常疾病的诊断有较大参考意义，是围产期监护的最佳诊断试剂。

主权项

1、一种人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法，该方法采用如下步骤：(1)人胎盘泌乳素的提纯(1.1)饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000-10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；(1.2)葡聚糖凝胶柱层析取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3mol/lNaCL和0.05mol/ltris-HCL缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用人胎盘泌乳素血球试剂检查各管浓度，收集人胎盘泌乳素高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；(1.3)人胎盘泌乳素偶联琼脂糖亲和层析取琼脂糖10-40ml，经0.5mol/lNaCL和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/lNaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH7-11的0.1mol/lNaHCO3透析的人胎盘泌乳素抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/l磷酸盐或0.5mol/lNaCL缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入人胎盘泌乳素抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.0lmol/lPH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/l甘氨酸一HCL缓冲液PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集人胎盘泌乳素高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；(1.4)抗人全血清抗体偶联琼脂糖亲和层析柱制备与人胎盘泌乳素抗体偶联琼脂糖相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐人胎盘泌乳素样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为人胎盘泌乳素纯品；(2)人胎盘泌乳素抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，人胎盘泌乳素抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg人胎盘泌乳素抗原，以后每间隔-周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；(3)人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；(4)人胎盘泌乳素抗血清致敏醛化血球取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/l醋酸钠配成1-10％体积比的血球，将人胎盘泌乳素免疫球蛋白分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应1-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出人胎盘泌乳素冻干诊断血球；(5)将人胎盘泌乳素冻干诊断血球用0.02mol/lTris-HCL、0.15mol/lNaCL、0.05％重量比的NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积煮沸后冷却40-70℃的1-4％体积比的琼脂液，混合均匀铺板，琼脂厚度1-4mm，打孔直径1-5mm，孔距0.5-3cm。