[发明专利]不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株的方法

摘要

本发明属于不结球白菜非对称细胞融合方法及其获得的再生植株，专用于新种质的创建。包括：原生质体的制备、OguCMS下胚轴原生质体核失活处理、保持系子叶原生质体的钝化处理(线粒体)、非对称原生质体的电融合和融合产物的培养。获得再生植株后代98H秋-45为新种质，其不育率、不育度均为100％，低温下苗期叶片不黄化，结实率与保持系相同，并极显著高于原不育材料；经PCR扩增cpDNA和mtDNA的电泳证实为体细胞杂种。

主权项

1.一种不结球白菜非对称细胞融合获得再生植株方法，其特征在于： 1)原生质体的制备：取5d苗龄的不结球白菜OguCMS下胚轴和14～18d 苗龄的保持系子叶，分别在1.0～2.0g/100ml纤维素酶+0.1～1.0g/100ml果胶酶 +10mMCaCl₂·2H₂O+0.7mMKH₂PO₄+0.5M甘露醇的酶液中游离25～60h，500rpm 下离心收集原生质体； 2)OguCMS下胚轴原生质体核失活处理：将获得的OguCMS下胚轴原生质 体，调整其密度为1.5×10⁵个/ml，以剂量率为15Gy/min的⁶⁰Co照射，以不照 射为对照，OguCMS下胚轴原生质体的核失活剂量为100～150Gy； 3)保持系子叶原生质体线粒体的钝化处理：诺丹明溶解于含10.0g/100ml 二甲基亚砜的融合液中，配成1mg/ml的母液，用1NNaOH调pH为5.8，抽滤 灭菌，使用时调至所需浓度，在25℃的条件下处理30min，融合液洗涤两次备 用； 4)非对称原生质体的电融合和融合产物的培养：将核失活的OguCMS下胚 轴原生质体与钝化线粒体后的保持系子叶原生质体按体积比1∶1的比例混合， 在融合电极间进行融合，融合产物与等量的2倍改良KM8P培养基混合后，进 行液体浅层培养或包埋培养，60h左右进行第一次分裂，前2周为暗培养，之后 于散射光下培养，1个月后获得肉眼可见的愈伤组织，并将其增殖，转移到分化 培养基中分化出不定芽，不定芽生根后，形成完整幼苗，经炼苗后，转移到盆钵 中栽培，选出其中的不育株用保持系花粉授粉，分别收获种子。