[发明专利]一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法

摘要

本发明属于一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法，包括：田间鉴定、细胞染色体鉴定、酯酶、过氧化物同工酶电泳分析、分子生物学鉴定。本发明对融合再生植株后代进行了花器形态学、雄性不育性及结实率鉴定，细胞染色体鉴定，同工酶分析和分子生物学鉴定，结果准确可靠。鉴定的98H秋-45为新种质，其不育率、不育度均为100％，低温下苗期叶片不黄化，结实率与保持系相同，极显著高于原不育材料；经PCR扩增cpDNA和mtDNA的电泳证实为体细胞杂种。

主权项

1.一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法，包括：1.1)田间鉴定：鉴定新种质苗期有无黄化，花期鉴定育性，自然条件下的结实情况，同时与保持系和原不育材料进行比较12℃以下条件下的叶片黄化程度、不育率与不育度、自然条件下的结实情况，新材料没有出现叶片黄化现象，不育率、不育度均为100％，平均单株结荚数、平均单株结籽数、平均单株种子重分别为446.3个、6232.6粒和13.40g，但与原不育材料间均达极显著差异；1.2)细胞染色体鉴定：供试种子分别在垫有湿滤纸的培养皿中，常温下发芽，种子露白后，移至冰箱中处理20～30h，移至20～28℃培养箱中培养16～20h，剪取2条根置0℃冰水混合物中处理24h左右，然后用卡诺固定液固定，制片时取出根尖，45ml/100ml醋酸压片观察计数，鉴定新材料的染色体数目与保持系和原材料的一致性，新材料的染色体数目与保持系和原不育材料完全一致，均为2n＝20，并且都有一对带随体的染色体；1.3)酯酶、过氧化物同工酶电泳分析：供试材料同时在常温条件下播种发芽，每份材料的3粒种子按胚根、下胚轴、子叶三部分分别制备样品，在1.5ml塑料离心管中冰浴研磨，每管加入提取缓冲液0.1ml，采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，每一样品加样量30μl，0.01g/100ml溴酚兰作指示剂，电泳在4℃冰箱内完成，时间3～4h，采用坚牢蓝染色法染色酯酶同工酶凝胶，新材料胚根和下胚轴酯酶同工酶图谱结果与原不育材料和保持系比较差异，采用联苯胺染色法染色过氧化物同工酶凝胶，新材料的胚根和子叶过氧化物同工酶与保持系、原不育材料比较差异，新材料的酯酶同工酶有10条谱带，比保持系多3条谱带，比原不育材料少一条弱带，新材料子叶的过氧化物同工酶有5条谱带，不仅比双亲多一条弱带，而且Rf值较大的一条带比双亲均强；1.4)分子生物学鉴定：新材料和保持系一半的幼苗在取样前3d进行遮光黄化处理，提取线粒体NDA和叶绿体DNA，采用两个引物进行线粒体DNA和叶绿体DNA的PCR扩增，引物的序列分别如下：Primer15′-ATGGGAAGGGTAGGT-3′Primer25′-GTCGATATGGCGAGTCC-3′引物浓度均为20μM，PCR扩增的条件为：93℃/1min变性---55℃/1min退火---72℃/2min聚合，延伸30个循环，扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，比较原OguCMS与新材料和保持系叶绿体DNA和线粒体DNA总量差异及三份供试材料之间的线粒体DNA和叶绿体DNA差异，三份材料中保持系的叶绿体DNA含量最高，分别是新材料和原OguCMS的10倍、30倍；新材料的叶绿体DNA介于双亲之间，其含量是原OguCMS的10倍左右；从线粒体DNA含量来看，原OguCMS材料最高，分别是新材料和保持系的6倍、8倍，新材料的线粒体DNA含量也介于双亲之间；新材料和保持系无论是叶绿体DNA，还是线粒体DNA均含有RNA；而原OguCMS材料的叶绿体DNA和线粒体DNA中均不含有RNA。