[发明专利]用大肠杆菌表达机体保护因子串联体

摘要

用大肠杆菌表达机体保护因子串联体,涉及基因工程技术。其特征是按大肠杆菌惯用密码子合成BPC基因,采用串联体的方式,使BPC在大肠杆菌中得以大量(15%)表达,采用常压离子交换方法加以纯化。具有分离纯化方法简单,成本低,易于放大,工艺取材不受限制,获得的BPC生物活性物质纯度高、活性高等优点,具有很大的经济与社会效益。

主权项

1、用大肠杆菌表达机体保护因子串联体，其特征是：首先按照大肠杆菌的惯用密码子把BPC的15氨基酸转化为以下核苷酸序列：EFRSMGEPPPGKPABcoRⅠ/GluPheBglⅡ/ArgSerMetGlyGluProProProGlyLysProAlaGAATTCAGATCTATGGGTGAACCGCCACCTGGTAAACCAGCTCCTAAGTCTAGATACCCACTTGGCGGTGGACCATTTGGTCGADDAGLVMGSSRAspAspAlaGlyLeuValMetBamHⅠ/GlySerStopcodenXbal/SerArgGATGACGCAGGTCTGGTAATGGGATCCTAATAGTCTAGACTACTGCGTCCAGACCATTACCCTAGGATTATCAGATCT然后在BPC基因前依次接上核酸内切酶EcoRⅠ、BglⅡ，蛋氨酸对应的核苷酸序列，在BPC基因后依次加上蛋氨酸、核酸内切酶BamHⅠ、终止密码子(TAA、TAG)、XbaⅠ对应的核苷酸序列。把pUC19用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，然后把退火过的BPC基因连同其前后的附加序列用T4DNA连接酶与pUC19/EcoRⅠ+XbaⅠ连接后，克隆入pUC19的EcoRⅠ和XbaⅠ位点，酶切、测序证明正确的克隆经扩大培养后，提取质粒，分为两份，一份用ScaⅠ+BamHⅠ酶切(PromegaButterB)，回收其小片断部分(905bp+60bp=965bp)，一份用ScaⅠ+BglⅡ酶切(PromegaButterB)，回收其大片断(1754bp+69bp=1823bp)；两份回收部分再进行连接，如此重复二次，直到产生4串体或8串体为止。上述克隆技术路线如下：EcoRⅠBglⅡMetBPC基因MBamHⅠstopcodonXbaⅠAATTCAGATCTATG========ATGGGATCCTAATAGTCTAGA采用BamHⅠ和BglⅡ酶切后实现BPC基因的串联，然后克隆入pThioHisA/EcoRⅠ+XbaⅠ位点，用重组子转化大肠杆菌，进行表达。