[发明专利]抗龋齿菌IgY的制备及防龋齿组合物

说明书

本发明属IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)的制备，特别是抗龋齿菌IgY的制备及以IgY和抗菌剂作为有效成份的防止龋齿的组合物。

变链菌被公认为是龋齿主要的致龋菌。目前对变链菌进行被动免疫的措施有两种，一是将单一的或混合的变链菌菌体作抗原，免疫母牛或母鸡，从牛乳或鸡卵黄中提取抗体，进行被动免疫防龋；二是将变链菌菌体中的葡糖基转移酶作为抗原，免疫母牛或母鸡，从牛乳或鸡卵黄中提取抗体，进行被动免疫防龋。但现有的抗体制备技术存在以下问题：(1)抗体制备成本过高，特别是用葡糖基转移酶作抗原时，抗原提取困难；(2)抗体的效价较低，现有制备技术抗体效价最高也只有1∶320；(3)鸡卵黄不能得到综合利用。

本发明的目的提出一种抗龋齿菌IgY的制备方法，使抗体的生产成本降低，抗体效价提高，鸡卵能得到综合利用。同时，提供以本发明的IgY和抗菌剂作为有效成份的防止龋齿的组合物。

本发明所述的抗龋齿菌IgY的制备方法如下所述：

取c型和d型两种变链菌，分别在BHI培养基或TTY培养基中培养2-3天；将培养好的两种变链菌分别进行离心处理，收集菌体，用pH值为6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体4-6次，50-65℃的温度下，加热25-35分钟，进行热处理，得到c型变链菌液和d型变链菌液。

将c型变链菌液和d型变链菌液，按1-2∶1的比例混合，并加入与上述两液体之总量等量的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得菌体抗原。

c型变链菌液和d型变链菌液的混合比例最好为2∶1。

每次取本发明的变链菌抗原1.0ml(10亿/ml)，对母鸡进行皮下或翅静脉注射，注射三次，每隔二周一次；取免疫蛋，用蛋黄筛取出蛋黄，搅拌均匀，加入4-6倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值至4.5-6.5，在3-5℃温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟，取其上清液，经超滤浓缩、除菌和冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY粗提物(粗品)。

将抗龋齿菌IgY粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析。用含0.03-0.1MNaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml。

将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经Sephadex G200凝胶柱层析。用含0.05-0.2M NaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY纯品。

DEAE-Sephadex A50层析柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度以0.07M为最佳。

Sephadex G200凝胶柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度以0.1M为最佳。

本发明选择c型和d型变链菌作为抗原菌体，是基于以下研究结果考虑的。

变链菌按其血清分型，有a、b、c、d、e、f、g、h等血清型，但是对口腔中变链菌的检测表明，c型菌株约占60-90％,d型菌株约占10％，其它几种血清型菌的检出率很低。所以，c型和d型变链菌是引起龋齿的主要血清型菌，选择c型和d型变链菌作抗原菌体，既避免了多种血清型混合菌作抗原时，主要血清型菌效用降低的问题；也避免了当单一血清型菌作抗原时，交叉免疫反应范围偏窄的问题。

另外，研究表明，从口腔变链菌的细胞壁提取出A和B蛋白抗原，其中c型变链菌的细胞壁含有A和B蛋白抗原，b型变链菌仅含有A蛋白抗原，a、d、e、f和g型变链菌则只含B蛋白抗原，所以，以c型菌和d型菌作为抗原，保证了抗体具有很大范围的交叉反应。

本发明采用水稀释法提取IgY，可使蛋黄的其它成份得到综合利用，而且工艺简单，成本低，无环境污染。

IgY SDS-PAGE实验表明，本发明IgY达到了PAGE纯，经分子量测定，IgY分子量为180,000道尔顿。

IgY理化实验结果表明，本发明IgY在65℃条件下，90分钟内仍保持有活性；在pH4.0-11.0的环境中，37℃、8小时后活性无明显变化，但在pH2.0和pH12.0时活性迅速下降，并且很快失活；本发明IgY具有较大的抗渗透压性质，可耐受40％的蔗糖渗透压。