[发明专利]从血清和血浆中制备DNA的改进方法

说明书

本发明涉及从血清和血浆中制备DNA的方法，特别是在扩增反应中用作目的DNA的DNA制备方法。

扩增和检测核酸领域的技术进展十分迅速，特别当其涉及对感染性疾病、癌症和遗传疾病提供早期检测的商业诊断试验时。目前已经知道少量核酸的扩增，例如PCR(聚合酶链式反应)已相当成熟的技术(参见美国专利号4683195；4683202；和4965188)。PCR的内在灵敏性，即其扩增非常低浓度的目的DNA的能力，意味着PCR产物低水平的遗留以及样品间的污染可以产生假阳性结果。在所有因素中，遗留和样品污染是处理过程中所需的样品操作次数的指标。因此，具有使样品暴露于周围环境的最少次数的简单程序是非常理想的。

传统上，已经就由全血得到的外周血白细胞(WBC)中经PCR鉴定了人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的病毒血症，并鉴定了其它病毒和细菌。在从WBC中提取HCMV DNA之前，通常需要从全血中分离WBC。这种分离程序包括红细胞在葡聚糖溶液中的沉降(Rasmussen等，传染病杂志.171：177-82，1995)，用氯化铵溶液差别溶解(美国专利号5702884，Ekeze等)，或者应用商业提供的方法(例如，来自Becton-Dickinson的CPT-Vacutainer^TM试管)。这些方法通常包括除去扩增的潜在抑制物的清洗步骤；或者，分离WBC以便除去这些抑制物，所述抑制物通常以高浓度存在于血浆或血清中。

分离出WBC后，溶解并提取DNA。这包括以下程序，例如煮沸、超声、或WBC的冷冻干燥，或者应用蛋白溶解酶和/或表面活性剂溶解细胞，然后提取DNA。提取DNA还可以应用碱溶步骤(美国专利号5639599)。通常进行更严格的提取/纯化步骤以便进一步确保纯化到的DNA不含潜在抑制物，这些步骤包括，例如，应用玻璃珠(Gene Clean II试剂盒，Bio 101，Inc.)、酚-氯仿提取程序、聚合物捕获(美国专利号5582988)，旋转柱吸附(Qiagen QLAamp试剂盒)，以及其它商业提供的DNA分离试剂盒(Puregene，Gentra SystemsInc.)。

值得注意的是，用于从WBC制备物中清洗掉或除去潜在抑制物的分离和溶解WBC的程序不能被用于血浆和血清。由于大量内源性生化物质和服用药物、药物的代谢产物等在血清和血浆中保留并严重累积，因此现有技术需要一种适用于血浆和血清的快速和强效的方法，该方法将除去潜在抑制物或使该抑制物失效。

感染个体中的胞外HCMV核酸存在于血浆和血清中。选择血浆和血清作为PCR检测HCMV核酸的样品正逐步被接受。通常，目的DNA不以游离DNA的形式存在，而作为与DNA、RNA和蛋白质的复合联合体的形式存在。必须从复合物中提取DNA，然后变性，以便使其适用于扩增反应。通常对血清和血浆样品进行加热、表面活性剂处理、和蛋白酶处理。常使用另外一些精确的方案提取目的DNA，例如前面描述WBC时提到的那些(Spector等，临床微生物学杂志，30：2359-65，1992；Nolte等，临床微生物学杂志，33：1263-66，1995；Wolf等，移植，56：330-4，1993；Patel等，临床微生物学杂志，32：1431-4，1994)。碱处理也曾被使用。然而，碱处理通常需要高NaOH浓度，随后需要中和步骤(Hansen等，传染病杂志170：1271-4，1994)。

因此，现有技术需要一种快速有效地从血清和血浆中提取DNA的并与PCR扩增方法相容的方法。

本发明提供了一种从血清或血浆样品中提取DNA的方法。该方法包括：

(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；

(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟；

(iii)离心加热的碱化血清或血浆；和

(iv)提取含DNA的上清液。

在一个优选的方面，在离心加热的碱化血清或血浆之前，在步骤(iii)离心之前，将由步骤(ii)制备的加热的碱化血清或血浆放冷，或冷却至室温，即25EC。

另一方面，本发明提供了一种检测在血清或血浆中可能存在含DNA的微生物，例如人巨细胞病毒(HCMV)的方法。该方法包括：

(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；

(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟；

(iii)离心加热的碱化血清或血浆；

(iv)提取含DNA的上清液；