[发明专利]杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法

说明书

本发明涉及改良杂交稻基因型过程，尤其涉及一种杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法。

三系杂交稻的质核互作型雄性不育系(以下简称不育系)和恢复系，以及二系杂交稻的光温诱导核不育系(以下简称为核不育系)和恢复系，都不具备抗御二化螟、三化螟、纵卷叶螟等鳞翅目害虫的能力，由它们所配制的F1杂交稻也都不抗螟害，特别是其中的籼型杂交稻，由于茎杆粗壮，茎部薄壁细胞多，维管束间距大，硅化细胞少，螟害更为严重。

我国是杂交稻生产大国，年种植面积达1600万公顷，约占全国水稻总面积的一半。据农业部有关统计资料显示，80年代以来，全国稻田遭受二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟为害的面积约为1000万公顷，防治面积为3000万公顷。近年来，随着耕作改制和害虫抗药性的提高，螟害呈现增强的趋势。

由于世界范围内抗螟虫和抗纵卷叶螟的种质资源十分贫乏，迄今未能选育出兼抗各种螟害的水稻品种和杂交稻组合。农民只能主要施用农药进行防治。估计我国每年用于防治稻田螟害的农药为1.5万吨。大量施用农药不仅导致水稻生产投入的提高，影响稻米品质，促使螟虫抗药性增强，且造成生态环境污染，严重影响人民健康。为此选育出新的抗螟虫杂交稻组合，使杂交稻本身具备很强的抗虫能力，是当前和今后一个长时期解决螟害，保证高产稳产的一个重要途径。

选育抗螟杂交稻，首先要有抗螟不育系或恢复系。利用我们通过转基因育种方法育成的抗螟Bt水稻(克螟稻)作亲本，采用杂交与回交的方法选育抗螟的Bt不育系或Bt核不育系以及Bt恢复系，是当前解决杂交稻螟害最有效的方法之一。

我们用农杆菌介导法选育成功的Bt转基因粳稻——克螟稻，已于1998年通过由浙江省科委主持的技术鉴定。克螟稻携有cryⅠAb基因，该基因全长186bp。在T-DNA区段与cryⅠAb基因串联排列的还有NPTⅡ、HPH及GUS基因，cryⅠAb基因的Bt结晶毒蛋白表达量平均为1％。克螟稻对二化螟、三化螟、纵卷叶螟，稻切叶螟、大螟、稻螟蛉、稻眼蝶、稻苞虫等8种鳞翅目害虫都具有100％抗性。1997年经农业部生物基因工程安全委员会审查，确定其生物安全等级为Ⅰ级。1998、1999年批准开展中间试验，2000年批准环境释放(农业部农基安审字99B-01-19号)。克螟稻是国内第1个育成的自交繁殖代数最高、抗虫性遗传最稳定、Bt毒蛋白表达量最大，最具育种利用价值的人工创制的抗螟水稻种质资源。

克螟稻的cryⅠAb基因为单拷贝插入，其杂种后代在抗螟性状上呈单基因显性遗传，故特别适宜作抗螟转育亲本。

本发明的目的是提供一种节省杂交稻生产成本，制止杀螟农药对环境污染，保证高产与稳产的杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法。

为了达到上述目的本发明采取下列措施：

杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法是以转基因育种方法育成的具高抗鳞翅目害虫的克螟稻为亲本，以三系杂交稻中保持系和恢复系以及二系法杂交稻的光温敏核不育系和恢复系为轮回亲本，通过连续回交，结合对杂种后代的种子与幼苗抗生素抗性筛选，β-核苷酸酶基因(GUS)活性检测，杂种植株DNA的聚合酶链式反应(PCR)和瑟慎(Southem)杂交鉴定，Bt毒蛋含量的蛋白质印迹法(Western blotting)测定，以及室内外的饲虫试验与抗性观察，选出综合性状与原亲本基本一致，但携有cryⅠAb基因的抗螟Bt保持系及其不育系、Bt核不育系及Bt恢复系。

本发明的优点与效果：免除或减少了生产Bt杂交稻种子的繁种田和制种田，以及免除了Bt杂交稻种植大田防治二化螟、三化螟和纵卷叶螟等害虫的药剂施用，节省了杂交稻生产成本与人力投入，制止了杀螟农药对土壤、水体与大气所造成的污染，保证了Bt杂交稻种子的优质高产以及Bt杂交稻的高产与稳产。目前全国杂交稻繁种田与制种田约为15万公顷左右，防治螟害的杂交稻生产田按1000万公顷计，以每公顷可节省农药施用量1.5公斤计，全国可免去1.5万吨的农药施用。按每年每公顷可节支工本90元左右计，全国约可节省杂交稻生产成本9亿元，挽回稻谷损失10亿公斤，同时大大减轻了农药造成的农田生态污染和稻谷的米质污染，并可适当压缩全国农药生产量。

下面结合实施例对本发明作详细说明。