[发明专利]一种十一肽及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及肽化学，特别是涉及一种新的11肽，其制备方法和用途。

APP11肽是我们首次发现的一种新的多肽，迄今尚未发现有关它肽的任何报道。

90年代中期曾经发现APP17肽，β-淀粉样肽前体蛋白(β-Amyloid precursor protein,APP)肽链中第319-335位的肽段具有神经营养作用，包括：促进轴突生长、增加突触密度、能保护缺血引起的脑神经元损伤。

本发明的目的是要寻找一种肽链较APP17肽短，合成较APP17肽容易的，具有神经营养作用的多肽。经过几年的研究我们最终发现了一种新的11肽，APP11肽，它不但具有神经营养作用，而且可能治疗神经元退行性变。

本发明的APP11肽是β-淀粉样肽前体蛋白N端第63-73位肽段，由11个氨基酸残基组成，序列为异亮氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸(IDTKEGILQYC)。我们经反复研究APP N端各种不同长度的多肽片段的生物活性，最终发现并确定APP11肽具有神经营养作用。

迄今为止我们的研究发现APP11肽具有如下功能：

1．在体外，能增加人神经母细胞瘤株SY5Y细胞胞体面积和轴突长度，促进细胞增殖和存活能力。

2．改善糖尿病小鼠的学习记忆功能和海马神经元中一些重要蛋白质的表达。

3．改善糖尿病小鼠坐骨神经传导速度和一些蛋白质的表达。

以上结果表明APP11肽具有神经营养作用，并存在改善实验性神经元退行性变的能力。

本发明APP11肽采用固相法合成，固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。下式表示了这个合成过程。原料：

HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂)

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)

NMP氮甲基吡咯烷酮

DCM二氯甲烷

   甲醇    

哌啶

DMAP二甲基氨基吡啶

HOBT羟基苯并三唑

DCC二环己基碳二亚胺

TFA三氟乙酸

EDT 1,2-乙二硫醇

硫代苯甲醚

结晶苯酚

乙腈

仪器：

多肽自动合成仪(美国ABI431A型)

旋转蒸发仪(日本Yamato RE50)

高效液相色谱仪(美国PE151A型)

冷冻干燥机合成方法：

称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即0.1mmol于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的AA按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下：1．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

Fmoc保护的氨基酸

2．联接氨基酸到树脂上

3．脱去氨基酸的Fmoc保护基

4．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)

   HOBt/DCC

5．偶联

            新的偶联的肽-树脂

重复3-5直至合成结束，得到APP11肽的肽树脂。

IDTKEGILQYC-树脂350mg将肽链从树脂上切落：用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到APP11肽的粗品为100mg，收率为85％。APP11肽的纯化

高效液相色谱分离纯化：

条件：色谱柱    C₈10×100mm

      色谱仪    ABI 151A型          美国

      流动相    A-0.1％TFA(三氟乙酸)H₂O

                B-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈

      检测波长  214nm

      流速      4ml/分钟

      洗脱梯度  20-60％B于30分钟HPLC(高效液相色谱)分析

      色谱柱：  C₁₈4.6×150mm