[发明专利]纳豆激酶的生产方法及其用途

权利要求书

1.一种纳豆芽孢杆菌，其特征在于本菌株确定为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)X-501，该菌株保藏于北京的CGMCC，保号为0449。

2、一种由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌X-501培养产生的纳豆激酶。

3、一种由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌X-501培养产生纳豆激酶的生产方法，其特征在于：

1)纳豆芽孢杆菌X-501在大豆或大豆制品为培养基上进行固体或液体发酵；

2)固体发酵或液体发酵

固体发酵：

采用水发黄豆破碎或不破碎，灭菌后直接接种进行发酵，豆饼粉、豆渣、脱脂大豆粉也可用做发酵原料；发酵时温度控制为22-40℃，相对湿度控制为80-95％，发酵周期为18-60时；

液体发酵：

采用豆乳做发酵基质，可稀释或不稀释进行发酵；利用大豆粉、豆饼粉、豆渣使用量为1-8％，添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆芽孢杆菌X-501对纳豆激酶的分泌，牛肉膏使用量为0.2-2％，玉米浆使用量为0.5～1.5％发酵时温度控制为22-40℃，发酵周期18-48小时，pH值控制为6.8-7.0；

试验时摇瓶培养条件：

500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为180-240rpm；

生产时发酵罐培养条件：

通气控制为1∶04-1∶1 v/v/min，搅拌200-300rpm，罐温36-38℃，罐压0.03-0.05MPa；

3)提取

对于固体发酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化钠溶液在4-10℃下搅拌抽提1-2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去除菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl₂，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；

对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl₂，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；

4)纯化

经75％的酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6的磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度，高速离心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM32离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行Sephacryl S-100HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。

4.一种如权利要求2所述的纳豆激酶的用途，其特征在于，该纳豆激  酶沉淀物溶解脱盐后，可直接与辅料豆粉、奶粉、豆奶粉、糊精混合调配至所需要求的酶活单位，经冷冻干燥后制  成纳豆激酶胶囊或其他形式的保健食品；也可将纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后直接进行冷冻干燥，再用少量葡萄糖或乳糖调配至所要求的酶活单位制成保健食品添加剂。

5.一种如权利要求2所述的纳豆激酶的用途，其特征在于，上述纳豆激酶的纯化产品经冷冻于燥制成医用注射针剂。