[发明专利]促红血球生成素偶联物

说明书

红血球生成(Erythropoiesis)是指血红细胞的生成，以补偿细胞的损失。红血球生成是一种受控的生理机制，它提供足够的血红细胞用于组织供氧。天然状态下存在的人类促红血球生成素(hEPO)是由肾脏产生的，是一种刺激血红细胞生成的体液因子(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C．R．Acad．Sci．143：432；Erslev，AJ(1953 Blood(血液)8：349；Reissmann，KR(1950)Blood 5：372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，Wand Plzak，LF(1957)Nature(自然)179：633 1—4)。天然存在的EPO刺激骨髓中的定向类红细胞祖先的分裂和分化，并通过与类红细胞前体上的受体结合发挥其生物学活性(Krantz，BS(1991)Blood 77：419)。

利用重组DNA技术通过生物合成已生产出了促红血球生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(1986)Immunobiol．72：213—224)，它是插入在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)并在其中表达的克隆的人类EPO基因的产物。主要的、完全加工形式的hEPO的一级结构示于SEQ ID NO：1。在Cys⁷—Cys¹⁶¹和Cys²⁹—Cys³³之间有两个二硫键。没有糖基的EPO多肽链的分子量为18，236 Da．。在完整的EPO分子中，约40％的分子量是由该蛋白质上在糖基化位点使该蛋白质糖基化的碳水化合物基团带来的(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A和Fukuda，M(1987)J．Biol．Chem．262：12059)。

因为人类促红血球生成素在血红细胞生成中是必须的，这种激素可用于治疗其特征为血细胞生成低或缺陷型的血液疾病。在临床上，EPO被用于治疗慢性肾衰竭(CRF)病人的贫血(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM 316：73—78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)Ann．Intern．Med．111：992；Egrie，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl．33：262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)Ann．Intern．Med．110：108—114)，以及治疗化学治疗中的AIDS和癌症病人的贫血(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI In：MB，Garnick，ed．Erytihropoietin in Clinical Applications—An InternationalPerspective．New York，NY：Marcel Dekker；1990：p．30 1—324)。但是，由于其短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性，通过商业途径获得到蛋白质治疗剂，例如EPO，的生物利用率是有限的。这些缺点限制了它们临床利用的潜力。

本发明提供了一种促红血球生成素偶联物，所说的偶联物含有一种具有至少一个自由氨基基团并具有使骨髓细胞提高网状细胞和血红细胞产生的体内生物学活性的促红血球生成素糖蛋白，该促红血球生成素糖蛋白选自人类促红血球生成素及其类似物，该人类促红血球生成素类似物具有人类促红血球生成素的序列，该序列通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而被修饰；所说的糖蛋白与“n”个式—CO—(CH₂)_x—(OCH₂CH₂)_m—OR的聚(乙二醇)基团共价相连，其中每个聚(乙二醇)基团的—CO(即羰基)与所说的氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或者3；m是约450至约900；n是1至3；并且n和m的选择应使该偶联物的分子量减去促红血球生成素糖蛋白是从20千道尔顿至100千道尔顿。本发明还提供了含有本文所述的偶联物的组合物，其中，该组合物中其中n是1的偶联物的百分比至少是百分之九十。