[发明专利]人胸腺素α原基因突变体合成、表达及应用

说明书

本发明属生物技术领域，涉及人胸腺素α原的全基因合成、基因工程和含有胸腺素α原的制剂作为治疗人类免疫缺陷性疾病和癌症的治疗药物。

胸腺上皮细胞分泌的多种类激素在T淋巴细胞分化成熟的过程中起着重要的作用。胸腺素α1就是此类多肽之一，它是由28个氨基酸残基组成的等电点为4.2的酸性多肽，分子量为3KDa。它具有胸腺素组分V的部分功能。同时，在从胸腺素组分V分离α1时，发现了另一组分，它由35个氨基酸残基组成，其N-末端的28个氨基酸序列与胸腺素α1完全一致，具有与α1相同的生物学活性，称之为胸腺素α2。并且α1与α2C-末端最后一个氨基酸皆为谷氨酸，推测可能是某一分子较大的蛋白质在蛋白酶作用下分解成α1和α2两种活性成分。

Haritos等在液氮中直接匀浆新鲜胸腺后，迅速放入煮沸的磷酸盐缓冲液，以灭活内源蛋白酶，在进行蛋白分离时，并未发现胸腺素α1和α2，而得到一个分子量为12KDa的酸性蛋白，其等电点为3.55。氨基酸序列分析表明，其N-末端的前28个氨基酸残基与α1序列相同，前35个与α2序列相同，因此将该蛋白质称为胸腺素α原(prothymosinα，Pro Tα)。

以前胸腺素α原的基因克隆，都是通过PCR的方法，从其cDNA文库中扩增基因，由于其DNA序列中GC含量较高，因而表达水平一般偏低。国外多采用融合蛋白的方法进行表达，这又为以后的分离提取带来了困难，我们利用密码子的兼并性降低了其DNA中的GC含量，选择了大肠杆菌偏爱的密码子，进行了全基因合成，利用基因工程方法制备人胸腺素α原取得了成功。

本发明采用下述技术方案：

(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人胸腺素α原基因大肠杆菌偏爱密码子的全DNA片段，它可以在不改变产物人胸腺素α原的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高胸腺素α原基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤为首先设计DNA序列，将全基因和起始、终止密码子、酶切位点等分成12个片段合成正、反两链，然后再以正、反两条链的5′端第1段序列为正、反向引物，进行PCR扩增，得到PCR产物与pUC19连接，测序正确后将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成胸腺素α原表达质粒pThα。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使胸腺素α原占菌体总蛋白的20％左右，表达率经100次以上传代不降低。

(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达25左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在20-25％之间。产物表达量可达每升培养物200mg以上。

(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、热处理去除杂蛋白、阴离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。

所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点：①通过热处理去除了90％以上的可溶性蛋白，而目标蛋白胸腺素α原无损失；②由于胸腺素α原pI＜4，因而阴离子交换层析可去除几乎所有的杂蛋白；③最后一步凝胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。本工艺对三批各22.5L发酵产物纯化后每批可得纯品3-5g。

(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于人免疫缺陷性疾病和癌症的治疗。

本品在体外能明显提高淋巴细胞玫瑰花结形成率，据此可以测定胸腺素α原的生物活性。

胸腺素α原治疗病毒性肝炎或在增进免疫系统反应性方面的作用机理尚未完全查明。在多个不同的活体外试验，它促使致有丝分裂原激活后的外周血淋巴细胞的T细胞成熟作用，增加T细胞在各种抗原或有丝分裂原激活后产生各种淋巴因子例如α，γ干扰素，白介素-2和白介素-3的分泌和增加T细胞上的淋巴因子受体的水平。它同时通过对T4(帮助者/诱导者)细胞的激活作用来增强异体和自体的人类混合的淋巴细胞反应。胸腺素α原可能影响NK前体细胞的募集，前体细胞在暴露于干扰素后变得更有细胞毒性。在活体内，胸腺素α原能增强经刀豆球蛋白激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌白介素-2和增加白介素-2受体的表达作用。