[发明专利]一种从发酵液中直接提取聚羟基烷酸酯的一步分离法

说明书

本发明属生物工程技术领域。

聚羟基烷酸酯(Poly-3-Hydroxyalkanoates，简称PHAs)是微生物在不平衡生长条件下在细胞内积累的一类高分子材料，是一类物理性质类似于聚丙烯等化学合成塑料的热塑性聚酯，但它具有一般合成塑料所不具备的一些特性，如：生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性等，是替代化学合成塑料最具竞争力的代表之一。特殊的性质使其在工业、农业、医药、卫生、食品等方面具有广泛的应用前景，成为许多发达国家研究关注的热点。

目前PHAs的应用因其生产成本较高并未大量使用，而取决于生产成本高低和产业化的一个重要因素来自于PHAs的后提取。PHAs的后提取方法一般由3种：(1)有机溶剂法。此法的缺点是需要大量的有机溶剂，如三氯甲烷(欧洲专利46,017)、二氯甲烷(欧洲专利58,480)、丙酮、甲烷等，成本高，工作环境恶劣，劳动保护要求高，提取收率低。(2)次氯酸钠法(Biotechnology Techniques，3(4)：227-230，1989)。由于次氯酸钠具有很强的氧化性，提取过程使PHAs的分子量受到很大影响，为此，又有人提出表面活性剂-次氯酸钠法(Biotechnology Techniques，4(4)：221-226，1990)，虽然此法PHAs分子量的降解作用明显降低，但提取过程中需对细胞进行预处理，离心弃去发酵液，并在二步反应之间需对混合液进行固液分离，由于微生物细胞直径很小，需采用高速离心机，在大规模生产中很难实现，工艺复杂，收率低，高速离心是影响PHAs大规模后提取的瓶颈。并且反应体系中细胞浓度不超过100克(干重细胞)/升，存在很大的局限性。(3)酶-表面活性剂法(美国专利4,101,533，欧洲专利0145233A2)。此法的缺点亦在于需首先进行细胞预处理，并通过细胞热处理、酶处理和阴离子表面活性剂处理，才能得到高纯度的PHAs。工艺复杂，酶反应条件苛刻，并同样在每步反应之后需通过高速离心进行固液分离，成本高，工程放大困难。

本发明的目的在于PHAs的后提取工艺，无需细胞的预处理，无需高速离心机，并对细胞的高密度培养体系均适用。利用一般发酵工厂的普通提取设备，二步反应一步离心或过滤，即可得到高纯度的PHAs。本发明工艺简单，成本低，劳动强度低，提取收率高，为规模化生产提供条件。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)在利用微生物发酵法生产PHAs的细胞发酵液中，用NaOH溶液调节发酵液PH值分别为5.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、14.0，其中PH10.0作为优选PH值。

(2)加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、Triton-100、十二烷基磺酸钠等，其中十二烷基硫酸钠价格低、提取效果好，作为优选表面活性剂。搅拌反应。

(3)加入次氯酸钠、变形剂，搅拌反应。变形剂分别采用NaOH、KOH、氨水等碱性溶液，其中优选NaOH溶液作为变形剂。

(4)离心或过滤上述混合物。

(5)将得到的固形物用水洗涤并干燥即得PHAs成品。

本发明适用性强，不仅可处理聚羟基烷酸酯中的均聚物(PHB)，而且可处理聚羟基丁酸-羟基戊酸(PHBV)等共聚物，并对发酵液中的细胞浓度或细胞中PHA含量无要求，甚至可直接处理细胞浓度在160克(干重)/升发酵液以上的发酵产物，放大容易，并已在吨级规模上得到验证。

实施例1

提取对象：细胞内含聚3-羟基丁酸酯(PHB)的发酵液50ml

细胞浓度：164.4克(干重)/升发酵液

PHA含量：细胞干重的80％

阴离子表面活性剂用量与细胞干重中非PHA物质量之比：0.2∶1(w/w)

次氯酸钠用量与细胞干重中非PHA物质量之比：5∶1

本实施例的具体步骤如下：

在50ml发酵液中滴加30％NaOH溶液调节发酵液PH10，加入表面活性剂十二烷基硫酸钠0.4克(加水加热溶解后倒入)，搅拌反应10分钟后，加入次氯酸钠溶液4.5ml和变形剂溶液4.5ml，搅拌反应5分钟至固体析出即进行过滤，自来水洗涤后置70℃烤箱干燥至恒重。成品经气相色谱分析纯度为99.5％，粘均分子量6.9×10⁵Da，提取收率81.8％。

实施例2

提取对象：细胞内含聚3-羟基丁酸酯(PHB)的发酵液100ml

细胞浓度：107.0克(干重)/升发酵液