[发明专利]表达乙肝病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法及产品

说明书

本发明涉及表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。

乙型肝炎(HBV)是一种广泛传播、世界性分布的传染性疾病，根据世界卫生组织1996年的报告，1995年全世界死于乙型肝炎的人数约有110万，居各种传染病死亡人数的第四位，而且近年来有逐渐增加的趋势。中国也是乙型肝炎的高发区，50-70％的人群受过HBV的感染，全国至少有1.2亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)携带者，其中显现临床症状的病人约有3千万人。

乙型肝炎病毒的感染，不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切关系。乙肝病毒的顽固性和多途径的易传性，使乙肝成为一个严重的公共卫生问题。迄今为止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的特效药，因此，在日常生活中，如何保护健康人群，预防乙型肝炎的发生就成为人们要考虑的主要问题之一。

预防乙型肝炎的发生现在可以选择注射疫苗，目前广泛使用的乙肝疫苗依其来源可分为血源性的和基因重组多肽疫苗两类。

血源性的乙肝疫苗最初是从无症状的乙肝病毒携带者的血浆中提取22nm的病毒球形蛋白颗粒(HBsAg)，经福尔马林灭活或加热灭活制备而成的。1982年，美国和法国率先在高危人群和医务人员中推广使用血源性的乙肝疫苗，并取得了很好的预防效果。但是，应该指出，在使用血源性乙肝疫苗过程中还存在着一些问题有待解决：

(1)安全性：由于乙肝病毒不能在人工组织培养基中增殖，疫苗来源最初是从无症状的乙肝病毒携带者的血浆中提取22nm的球形蛋白颗粒(HBsAg)经福尔马林灭活或加热灭活制备而成，尽管大规模地接种已经证实其是安全的，但接种者还是担心疫苗可能没有被完全灭活或污染有其它的病毒和致病因子。

(2)血源来源有限：由于乙肝表面抗原携带者不是健康人群，不宜长期持续取血供生产乙肝疫苗使用，因此，生产疫苗的血源来源有限。

(3)价格昂贵：由于其制备过程、工艺要求严格，造成价格长期居高不下。尽管最近几年乙肝疫苗的成本和接种费用在逐渐减少，但儿童一剂接种费用在加拿大仍在12-28美元之间，在美国为7美元，中国约需40元人民币。

(4)接种也较麻烦，需经多次注射，且会引起局部疼痛和其它不适如发烧、恶心、呕吐、腹痛和腹泻等。

鉴于存在上述问题，中国卫生部在1997年10月已下文停止了血源性乙肝疫苗的生产和使用。

随着DNA重组技术的发展，在原核生物(大肠杆菌和芽胞杆菌)和真核生物(多种鼠LM细胞、Hala和酵母细胞)中表达HBsAg及HBcAg获得了成功。1986年，第一个基因工程疫苗-酵母菌表达的重组乙肝疫苗在美国被批准使用。中国也在九十年代初期研制成功了具有世界先进水平的基因工程重组乙肝疫苗。但这类疫苗仍需多次接种，价格较高，且一些人群在接种后不能够产生免疫应答反应。

对乙型肝炎病毒粒体结构组成的研究表明，其最外层的包膜含有三种蛋白，依据分子量的大小，分别称谓主要蛋白、中蛋白和大蛋白⁽¹⁾。

主要蛋白也称小蛋白，由226个氨基酸残基组成，由S基因编码，是病毒包膜及亚单位颗粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此称之为小蛋白。小蛋白是一种疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，分子量分别为27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天门冬酰胺上连接着一种复杂的糖基，在122位赖氨酸残基处有胰酶切割位点。S蛋白有三个疏水区段，分别位于7-23、80-98和169-226，被二个亲水区段分开。疏水区段的氨基酸比较保守，氨基酸的变异主要发生在亲水区段。HBsAg是一种构象性抗原，两个小蛋白分子由二硫键连在一起，构成二聚体，代表着结构单位，具有完整的HBsAg活性，其中第二个亲水区段，即122和155残基之间的主要蛋白片段含有大多数HBsAg组和亚型的决定簇。