[发明专利]一种微生物(Tr13)及其制备方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种微生物及其制备方法。

由于目前大多数植物包括烟草、花卉、蔬菜缺乏对真菌病害的抗病品种，植物真菌病害的防治目前仍是以化学农药防治为主。然而连续用药造成农药残留进而对人体产生危害以及病原菌抗药性的产生引起人们极大的关注。国际上已逐渐采取措施限制某些巨毒农药的使用、注册及更新注册。美国农业部通过法规文件指出；“当面临病虫害问题时，只要有可能，生物防治总是优先选择的方法。目前还没有一种对于烟草、花卉、蔬菜等植物真菌病害的有效的生物防治方法。

本发明的目的是针对目前没有有效的拮抗性微生物用于防治植物真菌病害，而提供一种从土壤中筛选培养出特定的拮抗性微生物来防治植物真菌病害，本发明还提供了该微生物的制备方法。

植物病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物来防治植物的病害。为了有效地分离筛选到能对上述各种植物真菌病害的病菌有抑制作用的生防菌株，本发明采取了特殊的土壤诱捕法，通过用病菌本身作诱饵及选择培养基、对峙培养法筛选到木霉菌Tr13(Trichoderma aureoviride)，该菌种已在中国专利局指定的保藏单位(中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心)保藏，其保藏登记号为CGMCC NO.0440。

Tr13菌株具有下述性质：

培养特征：

在PDA和在MA培养基上25℃，3-10天观察，菌落匍匐生长快、早期形成大量白色气生菌丝，绒絮状，分生孢子丛束间生其中，呈现点片环状排列，最初为灰白色，老熟时暗绿色，此时的气生菌丝似蛛网覆盖整个菌落表面淡黄绿色；MA培养基菌落背面脏黄色，PDA培养基背面淡色。

镜检形态：

菌丝分枝繁复、有分隔、壁光滑无色、菌丝体内含有油滴样物质，直径2-6μm，厚垣孢子少见；

分生孢子梗：主枝上的侧枝典型的清晰的成簇生长，多为对生或互生方式形成二级、三级分枝，常见二级分枝，最后形成松塔式分枝轮廓，通常分枝夹角略小于90度，着生在分枝上的小瓶梗2-3成簇，座生角度大，生长方向趋于分枝顶端；

瓶梗：形状长而细，基部略窄于腰部，从腰部以上变窄成长颈，有的小瓶梗腰部略弯曲，呈现不对称瓶形或“牛角形”，6-12×2-2.5μm，常见7-11μm×2μm；

分生孢子：壁光滑、绿色、倒卵形基部，具有明显截面，偶见卵形2.8-4×2-2.8μm。

上述微生物的土壤分离方法是：

用长满相应病菌菌丝体的尼龙网片做诱饵紧贴于无菌水润湿的土壤表面，每天光照12-15小时，25-28℃下培养5-8天后，将网片移到马丁洋菜培养基上，在培养基内加入青霉素、五氯硝基苯、利福平，使每个培养皿(约15-20ml培养基)分别含上述抗菌素达50ppm，培养得该木霉菌。

上述微生物的液体发酵生产方法，其特征在于该生产方法按以下步骤进行：

1)试管培养基：采用固体PDA马铃薯培养基，将该木霉种接种在试管培养基上，27-29下培养46-50小时；

2)扩大培养基：采用液体PDA马铃薯培养基，将试管中木霉菌接种在锥形瓶中，置于摇床上27-29振荡光照培养72-76小时作为种子液；

3)液体发酵培养基：采用理查氏酵母膏培养液，121灭菌30分钟左右待灭菌培养液冷却至27.5℃时，将锥形瓶中的培养物按5-7％的比例接入发酵液，27.5℃培养48小时得到相应拮抗菌的菌浆。

上述所得的木霉菌经一定的工艺流程制成微生物杀菌剂，用来防治植物真菌病害。

采用本发明的拮抗性微生物进行生物防治，一方面可以利用产生的代谢产物如纤维素酶、几丁质酶等分解土壤中植物残体的纤维素、几丁质，增加土壤中的营养成分含量，促进土壤中有机质转化，产生的植物生长素又有益于植物根系的发育，促进植物生长，诱导植物抗病性反应。另外它们又可以产生抑菌物质，抑制病原菌的生长，并能在未经消毒的土壤中广为传播，因而改善土壤肥力，减少化肥、农药造成的环境污染，对人畜无害，研究周期短，投入低，易于产业化商品化开发，为农业可持续发展创造条件。

实施例：

用长满相应病菌菌丝体的尼龙网片做诱饵，紧贴于无菌水润湿的土壤表面，每天光照12小时，25℃下培养天后，将网片移到马丁洋菜培养基上，在培养基内加入青霉素、五氯硝基苯、利福平，使每个培养皿(约15ml培养基)含上述各抗菌素分别达50ppm，以此作为选择培养基，筛选培养出该木霉菌。

微生物的液体发酵生产方法是：