[发明专利]应用中国天坛济南蛛细胞毒种制备地鼠肾细胞狂犬病疫苗的工艺方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种应用CTN细胞毒种制备地鼠肾细胞狂犬病疫苗的工艺方法。

目前的制备地鼠肾细胞狂犬病疫苗的工艺方法为：

毒种的来源：狂犬病毒aG株是用狂犬病固定毒北京株在地鼠肾细胞传代适应后，通过豚鼠脑内交替传代适应而成，由中国药品生物制品检定所保存与分发。

生产用毒种的制备：选择体重120-200克豚鼠，脑内注射aG株病毒，选潜伏期80-100小时，具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑，此毒种作为生产用毒种。

制备地鼠肾细胞：取12-14克地鼠，无菌取肾，用胰蛋白酶消化，分种于转瓶内，37℃养至单层。

病毒接种：将aG株脑毒种按一定比例接种于已长成单层的细胞瓶内，37℃继续培养。

病毒收获：接种病毒后，培养24-48小时后洗换，去掉生产液，换成维持液，33℃培养适当天数，收获病毒液。

病毒液的灭活、浓缩与纯化：于病毒液中加入1/4000-1/5000的甲醛溶液，灭活一定天数，然后超滤浓缩50-100倍，经柱层析纯化，制成半成品。

分装与销售：将检定合格的半成品无菌分装于安瓶中，待成品检定合格后销售。

目前制备地鼠肾细胞狂犬病疫苗的工艺方法存在一定的不足：疫苗生产用的毒种为豚鼠脑组织毒种，这种毒种不仅含有脑组织成份，可造成人体接种后的过敏反应，而且使用的豚鼠不是清洁级动物，可能导致外源因子污染，严重地影响着产品的质量。

针对现有犬苗生产工艺中存在的毒种问题，本发明的目的在于提供一种毒株是细胞毒株，不含有脑组织成分，并可以完全排除外源因子的污染，有利于提高狂犬疫苗的质量的应用CTN细胞毒种制备地鼠肾细胞狂犬病疫苗的工艺方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明的生产工艺过程为：毒种来源→毒种的制备→制备地鼠肾细胞→病毒接种→病毒收获→病毒液的灭活、浓缩与纯化→分装与销售。

毒种的来源：狂犬病毒CTN株是狂犬病固定毒经Vero细胞传代适应，可用于Vero细胞狂犬病疫苗生产用毒株，由中国生物制品检定所保存与分发。

毒种的制备：将Vero细胞适应株CTN株进行地鼠肾细胞的适应传代，使之由Vero细胞适应株逐步驯化成为地鼠肾细胞适应株，经过10-20代的传代适应，CTN株逐步适应地鼠肾细胞其毒力由开始的4.0左右至5.5logLD50/0.03ml，并稳定在5.5logLD50/0.03ml左右，然后选择10-20代建立基础毒种库和生产用毒种库，并将CTN地鼠肾细胞适应株命名为CTN-LS，并对毒种进行全面检定，所有检测结果均符合规格要求。毒种 项目   无菌.无支   外源因    纯毒试验      毒力         免疫效率   类型     原体检测    子检查    中和指数   logLD50/0.03ml   IU/2ml 基础毒种     合格       合格      10000        5.5            3.05CTN-LS-11                          ＞500为合格生产用毒种    合格       合格      7943         5.5            3.42CTN-LS15-20

制备地鼠肾细胞：取12-14克地鼠，无菌取肾，用胰蛋白酶消化分种于转瓶中，37℃继续培养。

病毒接种：将CTN地鼠肾细胞适应毒种CTN-LS按适当比例接种于已长成单层的细胞内，37℃继续培养。

病毒收获：接种病毒后培养24-48小时，洗换，去掉生产液，换成维持液，33℃培养适当天数收获病毒液。

病毒液的灭活，浓缩与纯化：于病毒液中加入1/4000-1/5000的甲醛溶液，灭活一定时间然后超滤浓缩50-100倍，经拄层折纯化，制成半成品。

分装与销售：将检定合格的半成品无菌分装于安瓶中待成品检定合格后销售。

本发明与原有的狂犬病疫苗制备方法相比，采用Vero细胞适应株CTN细胞毒种进行地鼠肾细胞传代适应，最终得到了一株适应地鼠肾细胞的CTN细胞毒株(CTN-LS)，该毒株是细胞毒株，不含有脑组织成分，并可以完全排除外源因子的污染，有利于提高狂犬疫苗的质量。

采用CTN地鼠肾细胞适应株CTN-LS制备疫苗与原毒株制备疫苗其质量比较：

      四批疫苗、CTN-LS株与aG株质量比较毒种  批次       毒力         效力    外源因    平均毒力       平均效力