[发明专利]一种新型重组葡激酶及其制备方法无效
| 申请号： | 00111627.4 | 申请日： | 2000-01-28 |
| 公开（公告）号： | CN1264736A | 公开（公告）日： | 2000-08-30 |
| 发明（设计）人： | 宋后燕;宋钢 | 申请（专利权）人： | 上海医科大学 |
| 主分类号： | C12N9/70 | 分类号： | C12N9/70;C12N15/58 |
| 代理公司： | 上海医科大学专利事务所 | 代理人： | 吴桂琴 |
| 地址： | 200032*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 新型 重组 激酶 及其 制备 方法 | ||
1、一种新型重组葡激酶，其特征在于：改变野生型Sak二聚
体结合面，即47-56位氨基酸(HR1)、104-113位氨基酸(HR2)区
的疏水性氨基酸，然后构建重组表达质粒，制备新型葡激酶分
子。
2、按权利要求1所述的新型重组葡激酶，其特征在于所述新
型葡激酶分子的蛋白质结构为：野生型Sak肽链的Lys109-
Gly110-Phe111替换为Arg109-Gly110-Asp111(RGD)或
Lys109-Gly110-Asp111(KGD)。
3、一种新型重组葡激酶的制备方法，其特征在于采用下列步骤：
(1)质粒pST-Sak为模板，以上游引物、突变引物、下游引物进
行三轮PCR扩增，与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，
核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变；
(2)突变体RGD/KGD-Sak基因与原核表达载体重组，形成表达
质粒，转化大肠杆菌，温度诱导RGD/KGD-Sak基因表达。
表达产物以包涵体的形式存在于工程菌内；
(3)发酵技术：用低营养培养基扩增工程菌，温度诱导前后
用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行补料，发酵参数为温
度30-42℃，氧容量为50％-80％，pH＝6-8，搅拌速度
随DO升高而降低；工程菌发酵后用高压破碎，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，尿素或盐酸胍溶解，稀释复性后用凝胶过滤，离子交换二步法纯化RGD/KGD-Sak产品。
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