[发明专利]双特异性单克隆抗体、其制备方法和用其制成的溶血栓剂

权利要求书

1．三源杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏于CCTCC，保藏号No.C200002，该细胞株分泌一种双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体一端抗尿激酶，另一端专一性抗纤维蛋白，而对纤维蛋白原无交叉反应。

2．双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体为IgG1型抗体，分子量150KD，对纤维蛋白的亲和常数为6.3×10^-10，对尿激酶的亲和常数为2.93×10^-10，而对纤维蛋白原无亲和性，系保藏于CCTCC、保藏号为No.C200002的杂交瘤细胞株所产生。

3．权利要求2所述双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：构建杂交瘤细胞后将杂交瘤细胞株进行无血清培养基培养，再进行补料培养，然后分离纯化双特异性单克隆抗体。

4．如权利要求3所述的方法，其中无血清培养基培养是在无血清适应后再用无血清培养基进行培养，所述无血清培养基包括：

(1)基本培养基DMEM/F₁₂(1∶1)；

(2)基本添加剂ITES：

I：低内毒素的胰岛素，5-20μg/ml

T：转铁蛋白，5-20μg/ml

E：乙醇胺，1-10μmol/l

S：亚硒酸钠，50-100nmol/l；

(3)辅助添加剂：地塞米松0.5-2ng/ml、腐胺10-15μmol/l、维生素E15-30μmol/l、维生素C15-30μmol/l和氢化可的松0.5-1μg/ml。

5．如权利要求4所述的方法，其中所述无血清适应包括如下步骤：将杂交瘤细胞在含15％小牛血清的RPIM1640培养基中培养，用有限稀释法逐步降低血清浓度，直至血清浓度为1％，每步均选择分泌抗体量变化不大的单克隆；细胞稳定在添加1％小牛血清的RPIM1640培养基中后，换用添加无IgG的1％胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，用有限稀释法逐步降低血清浓度，直至血清浓度为0％、细胞完全适应在无血清培养基中生长。

6．如权利要求5所述的方法，其中血清浓度的降低先从15％-10％-5％-4％-3％-2％-1％，换用添加1％无IgG胎牛血清的RPMI1640培养基后以1％-0.5％-0.2％-0.1％-0.05％-0％降低血清浓度。

7．如权利要求3所述的方法，其中补料培养包括以下步骤：

1)进行无血清批培养，起始培养基的葡萄糖浓度为2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L；

2)进行补料培养，细胞接种密度为1～2.0×10⁵个细胞/ml，培养初期采用表面通气，葡萄糖浓度降至1.0g/L以下时开始流加补料培养基，控制培养液中葡萄浓度为0.25-1g/L，谷氨酰胺浓度为0.5-2.0mM/L，当细胞密度升高至1.0×10⁶个细胞/ml上以上时，改为深层通气，培养过程中定时测细胞的氧耗率。

8．如权利要求7所述的方法，其中补料培养基葡萄浓度为0.5g/L，谷氨酰胺浓度为1.0mM/L。

9．如权利要求3所述的方法，其中分离纯化包括酸化、硫酸铵分级沉淀；纤维蛋白柱亲和层析、尿激酶柱亲和层析和分子筛S-200过滤。

10．溶血栓冻干剂，包含有效量的权利要求2所述双特异性单克隆抗体和尿激酶，其比例为2.5∶1-6∶1，及药用赋形剂。

11．如权利要求10所述的溶血栓冻干剂，其中双特异性单克隆抗体和尿激酶的比例为3∶1。

12．如权利要求10所述的溶血栓冻干剂，其中药用赋形剂为0.5-2％甘露醇、0.0004％吐温80、10mM PB和0.1M NaCl。