[发明专利]人尿抗瘤(菌)肽及其制备和应用

说明书

本发明属生物化学中的多肽领域。

人们很早就知道尿的药用价值，1943年Magnelia等首次将尿的提取物用来治疗癌症。1967年Burzynski等从人尿中分离得到了抗瘤酮，经电泳、高效液相层析进一步纯化得抗瘤酮A₁、A₂、A₃、A₄和A₅五个组分，后来又从A₁～A₅中分离得到一个共同的活性成份抗瘤酮A₁₀，其结构为类似二肽的3-苯乙酰胺基-2，6-口辰啶二酮。目前对抗瘤酮A₁～A₅和A₁₀抗癌作用的机制不甚清楚，但由于A₁₀的分子和形状类似于DNA的碱基，因此推测A₁₀可能是在DNA水平上嵌入其立体结构，从而形成了对致癌物质的拮抗而起到抗癌作用。国外已对抗瘤酮A₂、A₃、A₅和A₁₀进行了I期和II期临床试验，试验结果表明大部分可完全缓解，少部分缓解，部分稳定，极少恶化，而且抗瘤酮毒性极低。近年来已有几家实验室分别合成了抗瘤酮的类似物和衍生物，并观察了它们的抗癌活性。

抗瘤酮可望成为安全有效的抗癌药物，但由于文献报道的人尿中抗瘤酮的制备多属专利，且不适用于大规模生产，所用分离方法的材料、设备价格昂贵。实验室合成的抗瘤酮的类似物和衍生物活性较低，对L₁₂₁₀淋巴白血病细胞仅显示微弱的抑制活性。

近年来国内有“纯化尿”的报道，台湾学者与安徽医科大学第一附属医院联合进行的“纯化尿”I期临床试验表明“纯化尿”在癌症治疗上有诱导恶性细胞逆转走向良性，但这种“纯化尿”中什么样的物质起作用未见进一步报导。

关于人源抗菌肽，目前发现的有BP1、PIA2、defensins和cathelicidins等，其中defensins(防御素)是1997年发现的由29-35个氨基酸组成的阳离子多肽，有6个不变的cys残基，形成三个分子内二硫键，它们分布于人的血浆、胸膜液、尿和脑脊髓液等体液中，是一类广谱的抗微生物的活性肽。

本发明的目的是利用我国尿源丰富的有利条件，采用适合我国国情的分离纯化方法，从人尿中制备出前人尚未报道过的一种既抗肿瘤又抗菌的小分子多肽物质，定名为UAP。UAP是机体产生的天然抗肿瘤和抗菌物质，可抑制肿瘤和微生物的生长，而对正常组织和细胞几乎无影响，而且无免疫抑制作用。UAP可用来制备抗肿瘤及抗菌药物，用于治疗肿瘤和由病原体引起的各种相关疾病。

本发明可以通过以下措施来达到：

1、UAP的分离、纯化：

从500立升男性尿经提取尿激酶的废弃液中或孕妇尿经提取绒毛膜促性腺激素后的废弃液中，加硅胶吸附剂，搅拌3小时后弃去残液，将吸附剂装柱，用含1.5％氨水和5.8g/ml氯化铵的水溶液洗脱，收集洗脱液，再经CSC-1树脂在柱脱色，收集活性部分，冻干得12g。上Sephadex G-25柱，用水洗脱，得2个峰(附图1)，峰1无活性，峰2有活性，收集峰2并冻干得2.4g左右较纯的UAP。UAP再经HPLC C18反相层析分离，用含0.1％三氟醋酸的25％乙腈等梯度洗脱，得4个峰(附图2)。峰2有生物活性，收集峰2再经一次HPLC C18反相层析分离，分离条件同上，得一个主峰(峰1)(附图3)，收集主峰分即得本申请的UAP20mg左右(附图4)。

2、UAP的其它分离、纯化方法：

从男性尿经提取尿激酶的废弃液中或孕妇尿经提取绒毛膜促性腺激素后的废弃液中，加树脂吸附，再经CM-纤维素层析等同样可得到UAP或类似于UAP的小肽及其衍生物。

3、UAP的鉴定：

UAP经5.7mol/L HCL水解12小时，进行氨基酸分析，知含Arg、Tyr、Pro、Phe、Leu、Gly、Ser、Asp、Glu、Val等氨基酸(附图5)

UAP经电喷务质谱测定得三个峰(附图6)，峰1分子量为174；峰2分子量为600.2、622.3和638.3，分别为一种小肽的游离羧基，钠盐和钾盐的形式；峰3分子量为763.3，所有小肽的分子量均小于1000。

从氨基酸分析和电喷雾质谱测定知UAP是3-4种小肽的混合物，每种小肽分子量均小于1000。