[发明专利]一种重组人单链白细胞介素－12的构建方法

说明书

本发明涉及一种由生物技术制备白细胞介素12(IL-12)的方法，特别是涉及一种重组人单链白细胞介素-12(rhscIL-12)的构建方法，

白细胞介素12(IL-12)是至今已知对免疫活性细胞诱导和调节作用最强的多功能细胞因子，天然IL-12是由两条多肽链通过二硫键共价结合的异二聚体蛋白，重链为P40蛋白，轻链为P35蛋白，IL-12只有在P40和P35以1∶1比例形成异二聚体时才有活性。本发明前一些研究人员通过分别构建P40和P35亚基的质粒进行共转染或在单一质粒中构建分别含P40和P35表达元件的载体，也有人用含有内部核糖体进入位点序列的转录病毒中多顺反子转录子表达P40和P35，或将P40和P35cDNA分别插入重组腺病毒载体的E1区和E3区进行表达。这些方法不但复杂，而且很难达到P40和P35以1∶1比例形成异二聚体，无法控制产生有活性的异二聚体蛋白。

本发明的目的是提供一种简单的使IL-12的P40和P35两条亚基能共同表达、并能使P40和P35以1∶1形式进行自然组合的重组人单链白细胞介素-12(rhscIL-12)的构建方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：一种重组人单链白细胞介素-12的构建方法，包括hIL-12(人白细胞介素12)P40和P35亚单位cDNA的克隆、hIL-12 P40和P35亚单位的基因融合、rhscIL-12(重组人单链白细胞介素-12)真核表达载体的构建，其特征在于：通过重组PCR技术将hIL-12的P40亚单位编码区cDNA序列的3′端和P35亚单位编码区cDNA序列的5′端，通过一个疏水性多肽的人工接头(Linker)进行拼接，构建rhIL-12(重组人白细胞介素12)P40-Linker-P35单链融合基因，并在真核细胞中表达得到rhscIL-12(重组人单链白细胞介素-12)。

具体方法是：以PDBu刺激人B淋巴母细胞株NC37细胞提取mRNA，以RT-PCR技术扩增hIL-12P40和P35亚单位cDNA，将获得的P40亚单位编码区cDNA序列的3′端和P35亚单位编码区cDNA序列的5′端，用一个编码疏水性多肽的人工接头——15氨基酸残基，通过重组PCR技术进行拼接，构建出rhIL-12P40-Linker-P35单链融合基因，插入pcDNA3.1真核表达质粒，构建rhscIL-12(重组人单链白细胞介素-12)融合基因真核表达载体，并转入哺乳动物细胞cos7，表达有活性的rhseIL-12。

与已有技术相比，本发明的突出优点是采用了公认的Linker即15个氨基酸残基的多肽接头，(它具有良好的柔顺性和折叠性，并具有足够的长度保证单链IL-12融合蛋白形成与天然IL-12类似的空间构象，)通过重组PCR对P40的3端和P35的5端进行拼接，构建出rhIL-12P40-Linker-P35单链融合基因，使P40和P35以1∶1的匹配形式形成异二聚体，保证了IL-12的活性，并可在一个启动子的控制之下翻译表达活性蛋白，达到控制产生异二聚体的目的。本发明可在生物工程领域的生产单位实施，实施本发明得到的产品—重组人单链白细胞介素-12(rhscIL-12)可广泛应用于免疫和瘤肿疾病的治疗。

动物体外实验证明，rhscIL-12具有增强T淋巴细细胞增生活性、刺激T淋巴细胞产生干扰素、刺激自然杀伤细胞增生、增强自然杀伤细胞活性、抑制单纯疱疹病毒复制、抑制肝癌细胞系增生的功能。动物在体实验证明，rhscIL-12可使裸鼠的移植性人肝癌完全消退。实验过程中，未发现所使用rhscIL-12对裸鼠有任何毒性。

实施例：

一、hIL-12(人白细胞介素-12)P40和P35亚单位cDNA的克隆：Nc37细胞株培养→Nc37细胞mRNA提取——RT-PCR合成IL-12P40和P35cDNA(具体步骤按Promege公司Access RT-PCR system说明进行)。分别插入pGEM-Teasy载体。

二、重组人单链IL-12(rhscIL-12)融合基因构建：

rhscIL-12P40和P35亚单位cDNA在一编码具柔性的疏水性多肽DNA片段的连接下构成人单链IL-12融合基因(rhscIL-12)。用于重组PCR的内引物根据Linker序列，P40 3端序列、P35 5序列进行设计，以overlapping extension原理进行基因重组。Linker为15氨基酸残基的疏水性多肽。具体步骤：以PCR分别扩增hIL-12P35和P40cDNA，以pGMET-P40和pGEMT-P35质粒为模板，分别用P40和P35内外引物进行扩增，并在真核细胞中表达，获得加有Linker互补序列的P40和P35PCR产物——重组人单链IL-12(rhscIL-12)。