[发明专利]一种鸡的球虫体外细胞培养模型及其应用

说明书

本发明涉及一种鸡的球虫体外细胞培养模型及应用该模型对抗球虫药物的药效进行筛选及药效监测的方法。

传统的同类研究，主要是集中在对鸡球虫的细胞组织培养研究方面，目前，尚未发现有将这种组织培养系统地应用于对抗球虫药物的筛选和药效监测的应用研究。而且，由于采用以往组织培养的培养基时球虫的卵囊产量低，影响了抗球虫药物效评价的准确度，从而使该药物的筛选无法正常进行。

本发明的第一个目的是提供一种能有效地应用于抗球虫药物的药效评价及筛选的鸡球虫体外细胞培养模型。

本发明的第二个目的是为上述模型提供用于评价和筛选目的的抗球虫药物助溶剂从而实现对抗球虫药物的药效评价与筛选。

本发明的第三个目的是在工艺操作上提高评价与筛选的效果。

本发明的第四个目的是建立评价抗球虫药效的评价指标。

本发明的第一个目的是这样实现的：一种鸡的球虫体外细胞培养模型，其包括在带有鸡肾细胞团组织的培养基上加入经纯化的球虫子孢子，在鸡体外培养球虫第一、二代裂殖体，直至形成卵囊，其特征在于：培养基的成份是在α-MEM培养基(市面有售)中加入动物血清3％-7％，溶液PH值为6.7-7.6。其中，加入动物血清的目的是增加球虫繁殖所需要的营养；血清浓度采用3％-7％为基本有效浓度；5％浓度左右为佳。上述PH值为球虫繁殖环境所需要。

本发明上述方案可以这样完善：动物血清是鸡的血清。加入微量胰岛素及叶酸。加入维生素B6 0.003mg/ml至0.007mg/ml。采用鸡血清作为营养成份最利于球虫的生长、繁殖；加入微量的胰岛素、叶酸、维生素B6能有效地改善球虫的生长、繁殖生理环境；对卵囊数量的有效增加起到很大的作用；胰岛素、叶酸的加入可以采用在调好培养基的基础上滴入的办法，例如：在α-MEM培养基中加入5％的鸡血清、0.05μg/ml胰岛素、0.005mg/ml叶酸及0.005mg/ml维生素B6。

本发明的第二个目的是这样实现的：一种在权利要求1所述的模型上进行抗球虫药物筛选的方法，其特征在于：加入抗球虫药物及其相应的助溶剂。抗球虫药物只有在溶解状态下才能发挥作用，所以，要用助溶剂溶解该药物。

上述方案中的采用不同的抗球虫药物必须用不同的助溶剂，因此本发明有针对性地进行了筛选，筛选结果表明：抗生素类抗球虫药物采用无水乙醇为助溶剂为好。非水溶性化学合成类抗球虫药物采用二甲基亚砜为助溶剂为好。水溶性抗球虫药物采用Hank’s液为助溶剂为好。

为了在工艺操作上提高平价与筛选的效果。抗球虫药物的投入与球虫子孢子的投入可以同时进行。实践证明：投药于球虫培养全期(与子孢子接种同时投药)比接种后再投药的效果要好，能更准确地评价药物的药效(当子孢子感染时，药效也同时产生)。

本发明的第四个目的是这样实现的：一种权利要求5所述的方法的抗球虫药物药效评价方法，其特征在于：以第二代球虫裂殖体数量或/和球虫卵囊数量为评价指标。采用兼顾球虫第二代裂殖体数量和卵囊数量的原则，即以前者为第一指标，后者为第二指标；以第一指标判断药物对患鸡治疗的效果(第二代裂殖阶段是造成鸡只死亡的主要阶段)，以第二指标判断药物对病源控制的效果(随患鸡粪便排出的卵囊是健康鸡群的传染源)。兼顾两个指标就能对药物的效果作出定量、准确的判断。

本发明由于采用了添加了动物血清(尤其是鸡血清)、胰岛素、叶酸、维生素B6的α-MEM培养基，因此形成了对监测、筛选抗球虫药物有良好效果的鸡的球虫体外细胞培养模型；又由于解决了不同类型抗球虫药物助溶剂的筛选与药物投入时机的选择使上述模型得到了完善。又由于成功地确定了球虫第二代裂殖体数量与卵囊数量作为判断药物效果的指标，使上述模型的药物评价、筛选得到定量化、精确化、标准化。

实施例1、用药为离子载体型抗生素抗球虫剂

1、鸡肾原代细胞团的制备：在无菌状态下，采集3-15天龄健康小鸡肾脏，经含0.25％胰蛋白酶的Hank s液消化两次，第一次5分钟，第二次15分钟，收集第二次消化后且含一定细胞团的肾上皮细胞，用稀释成每毫升1.5×10⁵个细胞，置24孔培养板中在40℃，5％CO₂条件下培养2.5-3天，待细胞覆盖面积达70％时，进行接种。