[发明专利]增效蛋白在原核生物中的表达及其应用

权利要求书

1.一种工程茵株，E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M20007。

2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于：该工程菌株携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因，并能够在原核生物中表达。

3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于所含的重组表达载体由下列DNA元件构成：

(1).粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；

(2).大肠杆菌质粒复制起始点；

(3).氨苄青霉素抗性基因。

4.一种构建权利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于：用SphI/PstI分别双酶切质粒pQE和重组质粒pGEM-T/En，并经0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的基因～2.5KbDNA带片段，用T4DNA连接酶于16℃水浴连接过夜，；转化感受态细胞E.coli M15，经氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板筛选得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的重组质粒pGEM-T/En由下面方法构建所得：

以TnGV基因组DNA作模板，设计引物：

P₁ 5’TCCTCCAATGTTGCACGATF，

P₂ 5’AACTGACTGTTGAACGTTAT，

PCR法扩增增效蛋白基因，得到全长约2.9Kb的片段，与pGEM-T载体用T₄DNA酶连接后，得到重组质粒pGEM-T/En。

6.一种用权利要求1-3所述的工程菌株生产粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的方法，其特征在于：将重组获得的携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99102单菌落挑到内含100μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养，以1∶4比例接种到含上述双抗500ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD₆₀₀＝0.7-0.9时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白。

7.权利要求1-3所述的工程菌株与昆虫病毒、苏芸金芽胞杆菌、阿维菌素或其它生物杀虫剂制备成复合生物杀虫剂在农林业用于病虫的生物防治，或单独使用增效工程蛋白用于转基因抗虫棉防治棉铃虫。