[发明专利]一种新的多肽——人spaseI酶11和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——人spaseⅠ酶11，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

信号肽酶(SPases)，有时也称导肽酶(Lep)，被认为是切除分泌蛋白信号肽的酶。在原核细胞中已知的Spases有三类，其中SPasesⅠ负责大多数输出的蛋白质前体的信号肽切除，SPaseⅡ则只作用于脂蛋白。

Motifs分析表明我们的序列中可能包含有SPaseⅠ。据资料显示大肠杆菌导肽酶[Lep(EC)]，鼠伤寒杆菌导肽酶[Lep(ST)]，酒酿酵母线粒体内膜蛋白酶Ⅰ,Ⅱ(IMP1和IMP2)都属于SpasesⅠ。真核细胞中去除信号肽的信号肽酶以低聚物形式存在，至少包含有五个亚基，定位于内质网膜上。哺乳动物信号肽酶复合体(SPC)的两个亚基SPC18和SPC21以及酵母的SEC11亚基，与原核细胞的SPasesⅠ酶都有相似结构。

所有的信号肽酶的数据显示它是一个膜本体蛋白，以Lep(EC)为例，参与催化作用区域的基因图谱显示该蛋白含有5个可辩结构域，分别是：2个跨膜区(H1,H2),1个较弱的疏水区(H3)和2个极性区(P1,P2)，并且氨基末端和C末端都面向周质。在体内H1-P1区域多与信号肽酶活性不相关，H2被不相关的疏水氨基酸取代对活性的影响也不大，证明其活性位点位于细胞周质结构域。

除线粒体Imp1以外，SPases酶对底物有很高的专一性。信号肽中有三个结构域是保守的：氨基末端结构域(n-region)，由1-5个氨基酸组成，至少有一个带正电荷的氨基酸；中央疏水区(h-region)，由7-15个氨基酸组成；极性更强的C末端结构域(c-region)，由3-7个氨基酸组成，并且是SPase的作用位点。另外，当h-region区过长时会阻碍SPase的催化作用，使蛋白随信号肽永久地驻留在膜上。能被Lep(EC)切除的最小底物有ALA↓KI，但效率比较高的底物是包含疏水区的FSASALA↓KI,↓表示切割位点。发现表面活性剂TritonX-100能加快导肽酶的催化活性，另外还发现磷脂能刺激导肽酶的活性，可能磷脂在催化机制中可能也起重要作用。

真核和原核细胞内编码SPase的基因序列都很相似。Lep(EC)的氨基酸序列与P.fluorescens和枯草杆菌酶分别有93％,50％和31％的同源性，线粒体Imp1与枯草杆菌酶有28％的同源，细菌信号肽酶与真核细胞的SEC11,SPC18和SPC21亚基也有20％-30％的同源性。用序列对准比较和定点致突变的方法得出SPase的Ser90是唯一一个保守的Ser，并且与活性相关。但与其它Ser蛋白酶家族相比，它又没有His作为质子的供受体参与活化。根据这一点，Black等人提出信号肽酶的催化机制可能于已知的β-内酰氨酶的作用机制相似。在SPase酶家族中Lys145替代了His的作用参与活化过程。Ser90打断易断裂的肽键，产生了一个酰基化酶中间物，该酰基化酶则通过水分子亲核攻击去酰基化，Lys145的作用正是使得水分子亲核性加强。这种作用机制中值得注意的特征是活性的Ser位点位于较弱的疏水区，靠近膜表面。真核细胞的信号肽酶复合体则比细菌中的导肽酶复杂多了，但它与Ser型的导肽酶最为接近。序列对准研究表明真核细胞的信号肽酶催化活性依赖于Ser/His二分体，而不象SPaseⅠ那样是依赖于Ser/Lys。

通过基因芯片的分析发现，在胸腺、睾丸、肌肉、脾脏、肺、皮肤、甲状腺、肝、PMA+的Ecv304细胞株、PMA-的Ecv304细胞株、未饥饿的L02细胞株、砷刺激1小时的L02细胞株以及前列腺组织中，本发明的多肽的表达谱与人spaseⅠ酶13的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为人spaseⅠ酶11。

由于如上所述人spaseⅠ酶11蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的人spaseⅠ酶11蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新人spaseⅠ酶11蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾1病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。

本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——人spaseⅠ酶11以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码人spaseⅠ酶11的多核苷酸的重组载体。