[发明专利]一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法无效
| 申请号： | 00114998.9 | 申请日： | 2000-03-20 |
| 公开（公告）号： | CN1314467A | 公开（公告）日： | 2001-09-26 |
| 发明（设计）人： | 毛裕民;谢毅;李瑶 | 申请（专利权）人： | 上海博道基因开发有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 200092 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 rna 逆转录 扩增 标记 探针 制备 方法 | ||
1、一种RNA逆转录扩增标记探针的制备方法，其特征在于，应用循环逆转录方法，
(1)CRT(循环逆转录)反应体系(50μl)为：在反应体系中加入1x反应液，Tris-HCl pH7.5-8.5,10-50mmol/l；(NH4)2SO45.0-25mmol/l；MnCl2 1.0-5.0mmol/l；DTT 0.5-5.0mmol/l；dNTP 0.05-1mmol/L；Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)0.04-0.2mmol/L；polydT18 0.5-2.0umol/l；耐热逆转录酶0.8-8U；mRNA模板50ng-300ng。
(2)循环逆转录(CRT)，即变性-复性-延伸的循环过程，其于PCR仪中的程序和条件为：
变性：温度条件：85-94℃，保温时间：5-120秒；
复性：温度条件：45-60℃，保温时间：5-100秒；
延伸：温度条件：55-70℃，保温时间：5-300秒。
循环次数：10-40个
然后进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。
2、如权利要求1所述的RNA逆转录扩增标记探针的制备方法，其特征在于，最适条件为，在50μL反应体系中含有Tris-HCl pH8.0,25mmol/l；(NH4)2SO4 10mmol/l；MnCl2 2.0mmol/l；DTT 2.0mmol/l；dA,G,C，各0.5-mmol/L；dTTP150mmol/L；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 150mmol/L；polydT18 4umol/L；FD酶(或Tth酶)5U；mRNA模板80ng。混匀后，在PCR仪上设置反应程序：87℃,10秒；55℃,10秒；65℃,60秒；循环次数：30个。然后乙醇沉淀进行纯化去掉未掺入的单核苷酸。
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